s-腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（３）：６１６６ ? Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达、 产物纯化及鉴定 田林奇　牛卫宁　左晓佳　钦传光 （西北工业大学生命科学院　西安　７１００７２） 摘要　将大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２）Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶（ＳＡＭＳ）基因克隆至质粒ｐＢＲ３２２中，获 得的重组质粒ｐＢＲ３２２ＳＡＭＳ转入大肠杆菌ＪＭ１０９菌株，构建了能高效组成型表达ＳＡＭＳ的重组 菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＢＲ３２２ＳＡＭＳ）。将重组大肠杆菌破碎后上清液经２０％～４０％硫酸铵分级盐 析、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ疏水层析和 ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析，即可得到纯度提 高５倍，比活为４８．７ ／ｍｇ的ＳＡＭＳ，三步纯化的总回收率为６２％，纯度达到９２％。ＳＡＭＳ表达量 μ 为１１７６／Ｌ，占到菌体可溶性总蛋白的２０％。重组酶的最适反应ｐＨ为８．５，４℃下在ｐＨ７．５的 μ 缓冲液中保温１０ｈ酶活性几乎不改变。重组酶反应的最适温度为５５℃ ，酶活性稳定的温度范围 ＬＭｅｔ ＬＭｅｔ ＡＴＰ 为２０～３５℃。重组酶的Ｋｍ 为０．２２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ 为 １．０７ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｈ），Ｋｍ 为０．５２ ＡＴＰ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ 为１．０５ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｈ）。 关键词　Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶　大肠杆菌　组成型表达　纯化　酶学性质 中图分类号　ＴＱ４２６．９７ 　　Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶 （Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｍｅ 生产成本较低，因而是较为有效的工业化生产方 ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ）是存在于多种生物体内的一种酶，能 ［８１０］ 法 。酶促转化法制备ＳＡＭ的酶源主要来自大肠杆 够催化 Ｌ甲硫氨酸和 ＡＴＰ生成腺苷甲硫氨酸（Ｓ 菌和酵母ＳＡＭＳ，大肠杆菌ＳＡＭＳ和酵母 ＳＡＭＳ相比具 ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｍｅ，ＳＡＭ）。在欧洲ＳＡＭ已作为药物广 有底物亲和力高、反应时间短、底物转化率高以及产物 泛用于肝病、抑郁症、关节炎等疾病的治疗，在美国已 ［１１］ 终浓度高等优点 。因此，来源于大肠杆菌的ＳＡＭＳ ［１３］ 经成为一种畅销的保健品 。我国ＳＡＭ的开发尚处 是催化合成ＳＡＭ的理想酶源。但ＳＡＭＳ在野生大肠杆 于起步阶段，市场需求在不断增长，但至今为止国内还 菌中含量少，活性不高，而且分离纯化困难。因此，构 没有企业被批准生产ＳＡＭ相关药物，国内用药全部依 建能高效表达大肠杆菌ＳＡＭＳ的工程菌并对重组酶进 赖进口，售价昂贵。因此，对ＳＡＭ制备方法的研究具有 行纯化和性质鉴定是酶促转化法大规模制备ＳＡＭ的关 十分重要的意义。 键问题。 　　目前，ＳＡＭ的工业化生产主要是酿酒酵母以及重 　　研究构建了能高效组成型表达大肠杆菌ＳＡＭＳ的 组毕赤酵母发酵法，但存在着生产周期长、底物转化率 重组菌 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＢＲ３２２ＳＡＭＳ），并建立了重组 ［４７］ 低、纯化工艺复杂以及能耗高等缺点 ，Ｓ