钙调磷酸酶对球孢白僵菌生物学特性影响.pdfVIP

中文摘要 钙调磷酸酶对球孢白僵菌生物学特性影响 微生物学专业硕士研究生吴迪 指导教师： 裴炎教授 张永军研究员 中文摘要 昆虫病原真菌是自然界控制害虫的重要因素之一，在害虫生物防治中具有广阔的应用前 景。但是作为一类重要的生防剂，昆虫病原真菌自身也存在击倒害虫时间过长和防效不稳定 等缺点，使得其广泛使用受到限制。主要原因在于，人们对昆虫病原真菌侵染致病的分子机 理研究较为薄弱，在实际应用中缺乏系统的理论指导。因此，加强昆虫病原真菌侵染致病的 分子机理研究，对促进真菌杀虫剂产业具有重要意义。 酵母到人类均具有较高的同源性。目前，钙调磷酸酶被认为是生物体应激反应时的中心调节 蛋白，并与真菌的孢子及菌丝形态、调节细胞内阳离子平衡平衡、细胞壁的合成以及病原真 菌致病性等相关。因此，钙调磷酸酶介导的信号途径是揭示真菌相关生物学性状分子机理的 重要线索。然而，钙调磷酸酶在昆虫病原真菌中的功能j目前尚无相关报道。 本论文以国内外广泛用于害虫生物防治的昆虫病原真菌球孢白僵菌儆口“坩，．缸6口豁缸，z口) 为材料，利用同源克隆分离了与构巢曲霉、稻瘟病菌钙调磷酸酶催化A亚基编码基因CNA 同源基冈BC^阴，并通过超量表达和反义抑制Bc^w研究了钙调磷酸酶与球孢白僵菌发育分 化、侵染致病以及逆境适应性调节等的关系，为探讨钙调磷酸酶在昆虫病原真菌球孢白僵菌 中的生物学功能奠定基础。 1．CNA同源基因BC?、H的克隆与特征分析 在分析多种丝状真菌CNA同源蛋白保守氨基酸序列的基础上，通过简并PCR和Ⅵ气DE 等方法，从球孢白僵菌中克隆得到一个CNA编码基因，命名为BC^纠fGenBank登录号： 含子，编码525个氨基酸，推测分子量为60kDa，等电点为6．04。BC^M推测氨基酸序列与 来源于禾谷镰刀菌(凡5口砌m c加豁口)，稻瘟病菌 gm优加阳朋_『，z)，粗糙脉孢霉(^k“胁pD，n (^砌肛口pD，．腩P矿括P口)和构巢曲霉(彳印已穆f池s以锄v肠，zs)等CNA高度同源，相似性分别为 87％、87％、85％和82％，并且具有保守的钙调磷酸酶B亚基(调节亚基)结合域、钙调素 结合域以及白抑制区域。Southem杂交显示，BCM基冈在球孢白僵菌中以单拷贝形式存在。 阳南大学硕十学何论文 2．BcM基因的表达分析 利用Real．TimeRT-PCR分析了BCM基因的表达特性。结果显示，球孢白僵菌在高温 (32℃)、高渗(0．5MNaCl)以及昆虫体壁诱导条件‘卜．，BCM表达水平均明显升高，且表 达水平随诱导时间的变化趋势存在差异。在昆虫体壁为唯一营养源的培养基中诱导培养12 hr的Ba忧表达水平最高。由此推测，男C^w可能参与病原茵的逆境适应性调节，并且与球孢 自僵菌寄生生长相关。 3．BcM基因的功能分析 为进一步明确BCM在球孢向僵菌中的生物学功能，利用超量表达和反义抑制BC艄 基冈，分析了Bc^W与菌株发育分化、侵染致病以及逆境适应性调节等的关系。主要结果 如下： Ba瞄对球孢白僵菌分生孢子的产生、活力以及菌落形态无明显影响。生物学特性分析 表明，反义抑制和超量表达BCM对球孢白僵菌产孢量、萌发率无显著影响。在正常培养条 9．O)以及高温(32℃)等培养条件 件，高渗(0．8MNaCl)、酸性(pH5．O)、碱性(pH 下，超量表达和反义抑制BC^H转化子菌落形态与野生菌株无明显差异。但在氧化环境(含 可能参与昆虫病原真菌球孢白僵菌对氧化环境的适应性调节。 BCM影响球孢白僵菌对杀真菌剂咯菌腈的敏感性。研究表明，反义抑制BC^M降低了 球孢白僵菌对杀真菌剂咯菌腈的敏感性，转化子对杀真菌剂咯菌腈产生明显抗性。超量表达 BC^阴的转化子和野生菌株相同，对咯菌腈敏感。由此表明，钙调磷酸酶信号途径参与球孢 白僵菌对杀真菌剂咯菌腈敏感性调：肖。 BC^M影响球孢白僵菌致病性。生物测定表明，反义抑伟归CM降低了球孢白僵I基对桃 蚜的毒力。在1×10。7孢子／ml浓度下，反义抑制B