对硝基苯酚降解菌Pseudomonas sp．PDS-7的降解特性及其降解相关基因的克隆.pdfVIP

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(11)：1486-1492；4November2008 ISSN0001—6209；CNll-1995／Q http：／，1ournals．im．ac．cn 对硝基苯酚降解菌Pseudomonassp．PDS-7的降解特性及 其降解相关基因的克隆 董小军，洪青，李恋，李顺鹏 (南京农业大学生命科学学院，农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京 210095) 摘要：【目的】本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌，研究其对 PNP的降解特性；克隆其降 解相关基因，并进行表达。【方法】本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离 PNP降解菌 株；采用形态观察、生理生化特征测定和 16SrDNA分析对菌株进行初步鉴定；通过摇瓶试验研究 菌株降解特性；利用 SEFA．PCR技术克隆降解相关基因，并亚克隆到表达载体 pET29a中，构建重 组表达质粒pETpnpC，再转入受体菌E．coliBL21(DE3)hh进行诱导表达 ；通过分光光度法测定表达 产物的酶活力。【结果】分离到一株PNP降解菌PDS．7，将该菌株鉴定为假单胞菌属 (Pseudomonas sp．)；该菌株能够以PNP作为唯一碳源、氮源和能源生长 ，菌株对 PNP的最高耐受浓度为80mg／L， 最适降解温度为 30。C，偏碱性条件有利于菌株对PNP的降解 ；克隆了PNP降解过程中的偏苯三酚 1，2双加氧酶基因pnpC及马来酰醋酸还原酶基因pnpD (GenBank登陆号 EU233791)；将 pnpC在 E．coliBL21(DE3)菌株进行了诱导表达，表达产物对偏苯三酚和邻苯二酚均有邻位开环活性，比活 力分别为0．45U／mgprotein和 0．37U／mgprotein，表明偏苯三酚 1，2．双加氧酶基因pnpC得到了活 性表达。【结论】分离鉴定了一株 PNP降解菌Pseudomonassp．PDS一7，研究了该菌株的降解特性 ， 克隆和表达了降解相关基因。 关键词：对硝基苯酚；Pseudornonassp．PDS．7；降解特性；基因克隆 中图分类号：X172 文献标识码 ：A 文章编号 ：0001—6209(2008)11．1486—07 对硝基苯酚 (PNP)是一种在环境中广泛分布的 属 (Moraxellasp．)及芽孢杆菌属 (Bacillussp．o这 硝基芳香族化合物 (NACs)uJ，它主要来源于有机 些菌株中存在的 PNP降解途径主要有两条 ：对苯二 磷农药，如：对硫磷、甲基对硫磷的水解以及医药、炸 酚 (hydroquinone)途径和偏苯三酚 (hydroxyquino1) 药、农药、染料等生产企业的排放2【’。由于PNP对植 途径 (图1)，前者在革兰氏阴性菌中较多5【，，而后者普 物、微生物、动物都有毒性，已被美国国家环保署列为 遍存在于革兰氏阳性菌 ，。但是，PNP降解基因克隆 优先控制污染物，限制其水体中浓度必须小于10ng／L4【】。 相关报道还较少。Bang等从Pseudomonassp．ENV2030 PNP的生物降解一直是环境科学研究领域关注课题之一。 中克隆了通过对苯二酚途径降解PNP的相关基因 J。关 近年来，国内外学者分离报道了多株 PNP降解 于通过偏苯三酚途径降解PNP及其相关的基因克隆方面 菌，主要分布在假单胞菌属 (Pseudomonassp．)、节 的报道共有3例 ，，加】，这些途径中的单加氧酶基因均属 杆菌属 (Arthrobactersp．)、红球菌属 (Rhodococcus 于二组分扩散性黄素蛋白单加氧酶 (two．component sp．)、伯克氏菌属 (Burkholdriasp．)、莫拉克斯氏菌 flavin—diffusiblemonooxygenase，TC．FDM )家族 。在 基金项目：国家 “863计划”(2007AA061101)；科技部 自然科技资源平台项 目(2005DKA21201—2) 通讯作者。Tel：+86