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第三章 固定化酶与固定化细胞第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 第一节 概述什么是固定化酶？第一节 概述二． 固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难第一节结束点击返回 第二节 固定化酶的性质及其影响因素一． 影响固定化酶性质的因素二． 固定化后酶性质的变化三． 评价固定化酶的指标一． 影响固定化酶性质的因素 1． 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。二．固定化后酶性质的变化1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降 2． 固定化对酶稳定性的影响 稳定性提高（原因） 3． pH的变化（原因） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低 固定化后酶稳定性提高的原因：a. 固定化后酶分子与载体多点连接。b. 酶活力的释放是缓慢的。c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。PH对酶活性的影响：（1） 改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。4． 最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5． 底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。6． 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km=Km/ρ(表观米氏常数)（1） 载体与底物带相同电荷，Si][S],ρ1,Km’Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si][S]，则ρ1,KmKm三． 评价固定化酶的指标：1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。——计量单位2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位——品质的体现3.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。4.操作半衰期： 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） ——衡量稳定性的指标。5. 6. 或称偶联效率，活力保留百分数。7.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化 酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。 四 固定化酶的活力测定方法介绍1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量。3. 连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。第二节固定化酶的性质及其影响因素提要影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标 第二节结束点击返回 第三节 固定化酶的制备一． 一般方法及特点二． 酶的固定化方法一． 一般方法及特点1． 四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较: 2． 选择方法依据： （1） 酶的性质（2） 载体的性质（3） 制备方法的选择3． 固定化后酶的考察项目：（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。（2） 考察固定化酶稳定性（ 2） 考察固定化酶最适反应条件二． 酶的固定化方法（一） 吸附法（二） 结合法（三） 交联法（四） 包埋法（entrapping method）酶和细胞固定化示意图（一） 吸附法 1． 物理吸附： 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。2. 常用载体：（1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂（2）有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷（二）结合法1. 离子键结合法2. 共价键结合法☆1. 离子键结合法概念常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度2 .共价键结合法（1）概念（2） 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、