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第十章 固定化酶 （Immobilized Enzyme） 酶的优点： 酶在工业中使用的缺点： 酶在水溶液中易失活 不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制 成本高。 理想的可用于工业的生物催化剂 ：既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化 固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 1916年，Nelson和Griffin将转化酶吸附在木炭上，活性与原酶一样 1948年，Summer制备出不溶于水的刀豆脲酶，具有原酶活性 1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。 固定化酶的优点： ①酶的稳定性得到改进； ②酶可以反复利用； ③可以管道化，连续化及自动化； ④酶与产物易于分开，产物容易提纯； ⑤反应所需的空间小； 固定化酶的缺点： ①固定化时，酶活力有损失； ②增加了生产的成本，工厂初始投资大； ③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜； ④与完整菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应； ⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。 第二节 酶的固定化方法 一、载体结合法 载体结合法是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。 1．物理吸附法： 这是酶通过氢键、疏水键等作用力物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。 载体：无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、谷蛋白、大孔型合成树脂、陶瓷等 物理吸附法优点： 操作简单 酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少 酶失活后载体仍可再生 物理吸附法缺点： 酶与载体相互作用力弱 对离子强度、pH、温度等因子敏感，酶易脱落导致酶活下降并污染产物 最适吸附酶量无规律可循 2．离子结合法： 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。 载体：多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。例如DEAE一纤维素（或葡聚糖凝胶），CM-纤维素，AmberliteCG-50，Dowex-50等。 离子结合法优点： 操作简单 处理条件温和 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏 酶活回收率较高 离子结合法缺点： 载体和酶的结合力比较弱 容易受缓冲液种类或pH的影响 在离子强度高的条件进行反应时，酶易从载体上脱落 3．共价结合（偶联）法： 酶以共价键结合于载体的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 操作时的两类方法： 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应； 在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。 可与载体结合的酶的功能团有α或ε- 氨基、γ- 羧基、疏基、羟基、咪唑基、酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性所必需的 共价结合法优点： 载体与酶偶联的方法多样化；酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 共价结合法缺点： 反应条件苛刻，操作复杂 偶联试剂对生命组织多有一定毒性 由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心（酶活回收率30％左右） 底物的专一性等酶的性质可能会发生变化 二、交联法 交联法是双功能或多功能试剂使酶分子之间交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。 交联剂：形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N,N’-乙烯双马来亚胺等。 参与交联反应的酶蛋白的功能基团：N-末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基等。 交联法的优缺点：优点是操作简便。缺点：反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般比较低，常出现扩散限制，使用有一定难度。尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活的提高。 酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。 这种“载体”蛋白可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。 三、包埋法 1、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型）