地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的研究与应用.pdfVIP

地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的 研究与应用 李瑶瑶，刁有祥 (山东农业大学动物科技学院山东省泰安271018) 摘要：利用PCR扩增鼻气管鸟杆菌(ORT)16SrRNA基因的671bp的特异性片段， 经同收纯化后用地高辛标记。建立了地高辛标记探针诊断ORT的方法。特异性试验表明，该 探针可与ORT不同血清型参考菌株的核酸发生特异性杂交，而与鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆 菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的核酸杂交均为阴性：敏感性实验结果表明该探针 对ORT的最低检出量为O．1ng；利用该探针对分离菌株进行检测，结果2株为阳性，与PCR 检测结果一致。该研究为oRT的诊断提供了一种敏感性高、特异性强、简便、易行的方法。 关键字t鼻气管鸟杆菌；地高辛标记探针；杂交检测 鼻气管鸟杆菌(OmimobactI嘶umrhinotr．acheale，ORT)是一种高度多形性、无运动性、 不形成芽胞的G．短杆菌，大小为O．2～0．6pm×O．6～5“m，属rRNA第五超科，具有化学器 官趋向性和嗜常温的特性，在分类上与里默氏菌属相似，至今尚未发现该菌有其它特殊结构。 ORT有18个血清型，用A．R依次命名，其中以A型最为常见。可引起鸡和火鸡的呼吸系 统疾病，表现为呼吸困难、关节肿大、产蛋率下降、死亡率升高、饲料转化率降低及生长抑 制。其剖检变化表现为心包炎、气囊炎、坏死性肺炎、支气管炎。该病以水平传播为主，但 也可以垂直传播，且常并发、继发或加重其他疾病如新城疫、波氏杆菌病及真菌感染，导致 鸡群出现大量死亡。该病曾在南非发生过两次大流行，最近，中国、巴西、土耳其、伊朗等 国家也有相关报道，给养鸡业带来严重的经济损失。 快速诊断是控制该病的有效措施之一，目前OI玎的诊断方法有常规的分离培养和血清学等 方法，但这些方法操作繁琐、费时、费力，且由于ORT存在于病鸡的气管和肺脏中，而在 这些部位同时存在其它杂菌，这就给该病的诊断带来很大困难。近年来分子生物学方法的建 立，以其特异、快速、敏感和易于自动化，适于早期和大量样品检测等优点，已成为疾病诊 16S 断中最具有应用价值和潜力的方法。本研究根据ORT rRNA基因序列设计引物，扩增 特异性片段，用地高辛标记，建立了地高辛标记探针检测ORT的方法。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1实验菌株 英特威公司潭子龙博士、丘鹤英博士惠赠；ORT分离株(编号为ORTl、OR他)，鸡大肠杆 (A00703)，由本实验室分离并保存。 1．1．2主要仪器 电泳仪、凝胶成像仪(Biorad，意大利)。 1．1．3主要试剂 I、Sal I等 DNA 均购自大连TaK窳a公司；硝酸纤维素膜(德国宝灵曼公司)；DIG-Highprime L加eling aIldDetection StalterⅪt(Roche生物工程公司)；其他相关化学试剂均为国产分析纯。 1．2方法 1．2．1细菌的培养 用PBS缓冲液复苏冻干保存的ORT参考菌株、分离株，接种于5％绵羊血液琼脂平板 上，在5％C02条件下37℃培养24h备用。鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌用普通营养琼 脂培养基，禽多杀性巴氏杆菌用血琼脂培养基，副鸡嗜血杆菌用鸡血清鸡肉汤琼脂(S．琼脂) 培养，均置于37℃恒温箱内培养18-24h。 1．2．2总DNA的制备 参照文献用PBS缓冲液收集ORT参考菌株、ORT分离株、鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、 L u 鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌，用30ulO％的SDS裂解缓冲液和3L蛋白酶K 消化。取上清液加等体积的苯酚／氯仿／异戊醇混合溶液抽提，上清液加冷异丙醇及3M乙酸钠 沉淀DNA，洗涤后．20℃保存。 1．2．3探针的制备 1．2．3．1探针模板的PCR扩增 以抽提的参考菌株核酸为模板，根据GenB