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第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 不同DNA抽提方法对PCR和实时荧光定量PCR方法 检测家蚕微孢子虫的影响 强1 何永强1，吴姗1，鲁兴萌2，邱海洪2，帅江冰1，张晓峰1，王素华1，徐国群1，李光才2，董 (1．浙江出入境检验检疫局技术中心，杭州310016；2．浙江大学动物科学学院，杭州310029) bombycis分子检测方法和DNA抽提方法，本文通过对家蚕微 摘要：为了优选快速、灵敏、特异的家蚕微孢子虫Nosema Green荧光定量PCR检测方法的建立以及反应体系优化，并与普通PCR方法进行 孢子虫TaqMan探针荧光定量PCR检测方法和SYBR 比较；再采用4种不同DNA抽提方法分别对PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫悬浮液的效果评价。结果显示，不经 过DNA抽提，直接将家蚕微孢子虫发芽液进行PCR反应的效果优于其它方法，检测灵敏度由高到低依此为直接法、酚／氯仿抽提 Green 法、动物组织DNA试剂金抽提法和植物组织DNA试剂盒抽提法；TaqMan探针法检测家蚕微孢子虫发芽液的灵敏度和SYBR 法相近，达到微孢子102个／mL，两者均优于普通PCR方法。试验表明，直接采用发芽液结合荧光定量PeR方法检测家蚕微孢子 虫最为简便、快速、灵敏。该研究结果将有助于提高家蚕微粒子病监控技术和检疫能力，对家蚕微粒子病的捡疫和防治具有 积极意义。 关键词：家蚕微孢子虫；DNA抽提方法；荧光定量PCR 家蚕微粒子病(Pebrine)是蚕业生产的毁灭性疫病，其病原微生物为家蚕微孢子虫Nosemabombycis (简称Nb)。家蚕微孢子虫可在家蚕幼虫、蛹和蛾体内寄生，并能经蚕卵传染下一代，对蚕业生产，尤其是 蚕种生产造成危害，且长期得不到根治。法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业 的毁灭。家蚕微粒子病的广泛流行不仅给蚕种生产单位造成严重影响，而且该病极易导致丝茧育蚕茧质量 的下降，造成巨大的经济损失(张志芳等，2000)。因此，家蚕微粒子病被世界各养蚕国家和地区列为蚕种 制作和进出口贸易的唯一检疫对象，也是蚕种业疫病监测和蚕病防治的重点和难点，我国将家蚕微孢子虫 列入《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(农(检疫)字第12号，1992)。 对家蚕微孢子虫的检测技术先后开展了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测和分子生物学检测等方法 Y，2003；邱宝利，2002) 的研究。随着分子生物技术的发展，PCR技术、核酸分子杂交技术(Hatakeyama 灵敏、特异的家蚕微孢子虫分子检测方法和DNA抽提方法。本文研究了SYBR PCR(包括TaqMan探针法和SYBRGreen法)检测家蚕微孢子虫的影响。这对提高家蚕微粒子病的监控技术 和检疫能力具有积极意义。 1材料与方法 1．1材料家蚕微孢子虫悬浮液(1×108Nb／IIIL)由浙江大学蚕蜂研究所提供。 mL(108 000 1．2家蚕微孢子虫发芽处理取0．5 Nb／mL)家蚕微孢子虫悬浮液，5r／min，离心5min，离 000 KOH0．25 h后5 r／min， 心后弃上清，保留孢子，同时加入0．2mol／L mL，充分混合，27℃诱导1 mL重悬，25℃放置30min，使孢子充分发芽。经 离心5min，去除诱导液，加pH=7．4的PBS缓冲液O．5 测定发芽率约为50％。将上述发芽