电脉冲激活体外成熟山羊卵母细胞原核发育研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 电脉冲激活体外成熟山羊卵母细胞原核发育的研究 王海“李继连2潘求真3王欢‘王玉患‘赵孟彬4陈大元17 4． (1。中网科学院动物研究所，I匕家1000802。海北冀艺方学院，河=l匕，0750003。表l艺农业大学，嚷尔滨150030 北京锦绣大地农业股份有限公司，北京100049) 摘要 本文对电激活体外成熟山羊卵母细胞原核发育进行了研究，以建立电激活操作程序。试验 发现，脉冲时程在40ps，场强迭到或超过1．0kv／cm才能有效地激活卵母细胞，场强在 低场强条件下，增加脉冲次数能提高原核形成率，但不能达到最佳激活效果；在1．2kv／cm高场强条 件下，一次脉冲就能有效激活卵母细胞，无需增加脉冲次数。卵龄在32h以下，随着卵龄蛹增加， 原核形成率在提高；卵龄在32h以上，原核形成率呈现下降趋势。 ， 关键谓l 山羊； 卵母细胞；孤雌激活； 电激活；原核 哺乳动物卵母细胞孤雌激活是核移植胚胎成功发育关键环节之一，也是了解受精和胚胎发育过 程中父源鑫素(精子)筋作用，戳及研究纯合二倍体毅及肿瘤发生帮诱发突变的重婺手段娃1。随着 体细胞核移植的成功，耳翦卵母细胞孤雌激活的研究又变得十分活跃。各圜学者对哺乳动物的孤雌 激活作了大量的研究，尤其在鼠、牛方面取得了很大进展。孤雌激活的方法很多，包括物理方法和 纯学方法，其中电秦|l激是特剐有效方法之一，该方法的特点是能够很好模拟精子触发的Ca2．波动， 曾经引起世人关注的“多裁羊”的制做过程中懵1，就是采用7电激活方法。迄今为止，关于山羊卵 母细胞电激活的研究报道很少。本试验对激活的山羊卵母细胞原核发育的电学参数作一探讨i为进 一步试验奠定基础。 { 材料与方法 1．1卵母细胞获得和培养 从剐宰杀的山羊体内剪下卵巢，用30℃灭菌生理盐水运圆实验室。用灭菌生理盐水溃洗卵巢三 次，放入盛有操作液的培养皿(中=100mm)内，用手术刀片刺破卵巢上直径为扣_5mm的卵泡，在 u1成熟 显微镜下挑选出含有完整卵丘细胞层和均匀胞质的卵母细胞，每15．20个卵母细胞放入50 液滴中进徭培券。操作液为TLH+3 11 酌[玎1雌二醇(Sigma) 1。2，；逛激活 + 成熟的卵母细胞用0．1％透明质酸酶除去卵丘细胞，选择形态良好具有第一极体的卵母细胞，随 机分组用于激活处理。激活处理是用BTX ECM一2001(BTX，SanDiego,USA)完成的。电激室是 由嚣根不锈钢丝平行霹定予有橇玻片四槽痰，擒成电激活夺室，闼距为0。5ram。毫激室悫充满激活 然后，移置卵母细胞于两根平行电极之间，施加一定电场强度进行激活，完毕后静置片刻，在SOF 5 液(0．3M甘褥醇+o．1mmol／LMgCl2+o．OmmolFLCaCl2)，在电激活前，卵母细胞用激活液洗涤3次， 发育液中洗30次，移入发育液滴中培养。’ 作者筒奔：王海(掬72一)，勇，博士，e—mail：wanghailllll@yahoo．com．cn 联系作者：陈大元，Tel：010e-mail：chendv@ioz．ac．cn l孵 串嚣畜牧兽医学会动物繁疆学分会第十三震学术研幸孛会论文集 1．3试验设计 l。3．1电场强度对山羊舞母细胞激活姆影响 0．8kv／cm、 在以下试验中使用。 1．3。2激活的山羊卵母细胞原核发育的情况 重复3次，在不同时间观察原核形成的情况。 1．3．3脉冲次数对卵母细胞激活的影响 kv／cm场强，以1次、2 卵母细胞成熟培养24h后，在401as脉冲时程情