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蜂花粉总黄酮检测方法的研究 孙丽萍、田文礼、朱晓丽、董捷 (中国农业科学院蜜蜂研究所) 摘要 黄酮类成分因其具有多样生物活性成为目前天然产物研究的热点。本研究通过三种 检测方法的比较，确定了聚酰胺一紫外分光光度法为蜂花粉总黄酮的测定方法，其检测波长 关系，相关系数R2为0．9998，平均回收率分别为98．17％，稳定性、精密度和重现性均理想， 量为1．54％。 关键词蜂花粉，总黄酮， 聚酰胺一Uv法，比色法，双波长比色法 目前，国内外对总黄酮的检测有若干种方法：比色法、胶束毛细管电泳法、高效液相 一色谱(HPLC)法等，大量实验数据表明，对于蜂花粉中黄酮类化合物的含量，采用不同分 析方法所得到的结果不同。 ’ 比色法是在碱性溶液中加A13+与3一羟基黄酮、5一羟基黄酮进行络合反应，利用颜色和 含量关系进行比色测定的方法。这是早期常用的方法，由于此法设备廉价，操作简单，现 比色法用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组成复杂的植物试样时， 比如花粉黄酮提取液，由于花粉组成复杂，受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多种物质 的干扰，在碱性条件下，许多多元酚都可与A13+发生同样的显色反应，而且底液常常出现 混浊现象，从而影响结果的准确性，使得测定结果远远高于蜂花粉总黄酮的实际含量。 为克服底液强吸收带来的干扰，研究人员对传统的比色法进行了改进，陈郑镔在使用 ‘传统的硝酸铝显色法时先用聚酰胺对样液进行吸附，以减少非黄酮类物质的显色干扰。郑 rlm为参比波长，采 敏燕(2004)采用双波长分光光度法，使用510nm为测定波长，584 用比色法测定油菜蜂花粉中的总黄酮，由于扣除了底液混浊等背景干扰，取得了比较满意 的实验结果。但双波长比色法的原理基于比色法，许多测定条件如稀释用乙醇浓度、显色 时间等都能影响比色法的最终结果，导致测定结果偏高、重现性不好。 聚酰胺一紫外分光光度法(出自《保健食品检验与评价技术规范》2003年版)是检测 保健食品中黄酮类化合物的常用方法(蒋娅萍，2003)，具有操作简单，设备要求低，检 测速度快，重现性好，灵敏度高等优点，但在蜂花粉黄酮检测中未见应用。 本实验考察了比色法、双波长比色法和聚酰胺一紫外分光光度法三种方法测定蜂花粉总 黄酮的差异，考察了不同前处理方法对检测结果的影响，建立了一种最适用于蜂花粉总黄 酮的检测方法，改变了由于蜂花粉黄酮检测方法不同导致所测黄酮含量结果不一致、缺乏 ．统一标准，从而造成无法以黄酮为指标对蜂花粉及其制品进行评价的现状，为现行蜂花粉 标准中所缺乏的功效指标的建立提供了有价值的参考依据，具有一定的理论意义和实际应 用价值。 1．材料与方法 1．1样品与试剂 油菜蜂花粉由中国农科院蜜蜂研究所提供，聚酰胺粉由巴陵石化有限责任公司提供， 均为国产分析纯试剂 ． 83 1．2仪器设备 HW．SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司 KQ一50DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 精密电子天平 梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司 WF2 UV-2100紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司 1．3．标准曲线的建立 ， 1．3．1聚酰胺法 芦丁标准液t精密称取在105℃干燥恒重的芦丁对照品5．Omg，用甲醇溶解，摇匀， 定容至lOOmL，使之成为浓度为50斗g／mL的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。样品处理： 精密称取样品1．09，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置。标准曲线的 管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm下测定吸光度，见表l。对所测得的数据采用 直线回归法计算出标准曲线的回归方程，并以吸