二噁英慢性暴露大鼠睾丸蛋白组学研究的论文.pdfVIP

致癌专业论文 二嘿英慢性暴露大鼠睾丸蛋白组学研究 马晓明 陈曦孙 徐媛婧刘乾汤乃军 【摘要】目的探讨二嗯英慢性暴露对大鼠生殖系统以及睾丸蛋白表达的影响。方法 嗯英；染毒结束后，采用双向凝胶电泳一质谱一生物学检索的经典技术路线，对二嗯英暴 露后睾丸蛋白表达谱进行分析；应用ELISA法检测血清性激素浓度，同时对附睾尾精子 进行计数。结果与对照组相比，二嗯英暴露后PERFl5蛋白表达下调，Sperm protein SSP411、UCH—L3和ZHl4 protein表达上调；二嗯英暴露扰乱了大鼠性激素水平。结论二 嗯英暴露影响了大鼠睾丸蛋白表达，所鉴定的差异蛋白可作为毒性标志物候选物。 二嗯英是一类有机氯化合物的总称，包括多氯二苯并一对．二嗯英和多氯二苯并呋喃， 此类物质在环境中极为稳定，属POPs公约首次列入受控的持久性有机污染物之一。二嗯 英毫无工业和商业价值，多伴随着垃圾焚烧和有机氯化合物的合成而产生，是一类非目的 性化学物质。二嗯英在食物链中具有明显的生物放大作用，人体主要以污染食物摄入的方 式暴露于二嗯英，其在体内可蓄积于脂肪，半衰期长达7年。 2，3，7，8一四氯二苯并二嗯英(TCDD)是二嗯英中毒性最强的一种，其具有广谱的 毒性作用和生物学效应，包括生殖发育毒性、肝毒性、致癌性、免疫毒性、皮肤毒性等【l】。 二嗯英也是环境中典型的内分泌干扰物，可阻碍、模拟体内正常激素的功能，从而导致内 分泌紊乱并引起一系列异常结局【2．3】。其中，生殖毒性和内分泌干扰成为近年来研究的热 点。睾丸对二嗯英暴露极为敏感，二嗯英暴露可影响睾丸发育和精子形成，并能导致血清 性激素的紊乱；而且，雄性大鼠暴露于二嗯英后可引起子代发育不良和男女性别比例的降 低。然而，对二嗯英生殖毒性机制至今尚不完全清楚。 本研究采用经典蛋白组学方法，即双向电泳一质谱一生物信息学检索的技术路线，对 二嗯英暴露后睾丸蛋白表达谱进行分析，探寻可能的二嗯英生殖毒性蛋白标志物和毒作用 靶标，以期对二嗯英毒性机制有进一步深入的理解。 1．材料与方法 1．1仪器与试剂 2，3，7，8-TCDD购自CambridgeIsotope 解配成100ng／ml的溶液，使用前以玉米油稀释至适当浓度，每周新配。IPGgelstrip 激素(FSH)酶联免疫试剂盒(Sigma公司)。 II(Amersham)、ProteanIIXi Multiphor 249 离心机、高精度扫描仪、凝胶分析软件、质谱仪。酶联免疫检测仪(奥地利TECAN公司， ECDM．F6124型)、离心机、温箱、光学显微镜、电子天平等。 1．2动物分组与染毒 院实验动物中心提供，饲养于放射医学研究所实验动物中心清洁级动物房，温度24-+2。C、 湿度50-+10％、12小时明暗循环，普通饲料喂养，自由饮水与取食，每周称重。实验动 物随机分为4组，每组8只，适应性饲养一周后染毒，高、中、低三个染毒组以灌胃方式 周，染毒结束后以股动脉放血方式处死所有实验动物。 1．3血清T、FSH、LI-I的测定 卵泡激素(FSH)浓度，操作程序严格按照试剂盒说明书。 1．4精子计数 摘取左侧附睾尾，称重后置于盛有5ml生理盐水的小烧杯中，用镊子撕碎后制成精子 悬液。从上述5ml悬液中取出0．1ml用生理盐水稀释至lml，混匀后用吸管取少量滴入牛 鲍氏细胞计数板中，计数5个中方格内精子数(N)，精子浓度为2Nxl04个／ml。 1．5睾丸蛋白组学实验 1．5．1睾丸总蛋白制备 取睾丸组织约200 mL裂解液，在 mg，剪成小块，放入预冷的玻璃匀浆器中；加入1 冰浴超声(O．5s，超声30s，停止30s， 冰上研磨lO次左右，转入离心管中，冰浴10mira 共3min，时间可适当延长)；以4℃14000rain，收集上清；用Bradford法