参青方对大鼠溃疡性结肠炎MAdCAM-1影响研究.pdfVIP

参青方对大鼠溃疡性结肠炎 MAdCAM-1 影响的研究 李凯 马贵同 柳文 唐志鹏 张亚利 (上海中医药大学附属龙华医院消化内科;上海中医药大学脾胃病研究所) 摘要 目的 通过观察参青方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜 MAdCAM-1 表达的影响， 探讨 MAdCAM-1 表达异常与结肠粘膜损伤的关系以及参青方对其调控机制。方法 SD 大 鼠随机分为正常组、模型 Ⅰ组、模型Ⅱ组、美沙拉嗪组、参青方低剂量组、参青方高剂量组 6 组，每组 10 只。用三硝基苯磺酸诱导 T 细胞免疫机制溃疡性结肠炎模型。于造模后第 3 天，处死模型 Ⅰ组大鼠，其余各组开始给药，连续给药 7 天后处死。采用 Western-blot 技术， 检测溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织 MAdCAM-1 蛋白表达的情况。结果 模型 Ⅰ组与模型 Ⅱ组 MAdCAM-1 蛋白表达量均高于正常组，且模型 Ⅰ组升高趋势更为显著（P0.01 ）。经 用药干预后，参青方治疗组 MAdCAM-1 表达呈下调趋势，与模型组比较（P0.01 ），且以 参高组降低趋势更为明显。结论 参青方可能是通过降低 MAdCAM-1 在结肠粘膜的表达水 平，从而抑制循环 T 淋巴细胞迁移至肠道粘膜炎症部位而下调炎症反应，达到缓解大鼠溃 疡性结肠炎的效应。 关键词 参青方；溃疡性结肠炎；MAdCAM-1 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis ，UC ）是一种病变局限于结肠黏膜及黏膜下层的炎症性 肠病，伴有溃疡形成，具有慢性、消耗性特征，且是一种能够导致结肠癌危险性增加的严重 组织破坏。UC 的病因及发病机制尚未完全阐明，但免疫-炎症因素在UC发生发展过程中起 着至关重要的作用。众多研究表明，UC发病过程中，单核巨噬细胞、中性粒细胞等产生大 量炎性细胞因子以及炎症介质。这些炎性因子一旦激活释放后，便可发挥其趋化作用，促进 结肠黏膜血管内皮细胞表面MAdCAM-1 的表达，并促使其与循环T淋巴细胞表面的归巢受体 即整合素α β相结合，从而介导T淋巴细胞向肠粘膜病变部位的定向归巢，引发炎症-免疫反 4 7 应。本研究旨在运用免疫组化、RT-PCR 、Western-blot法观察参青方对UC大鼠结肠粘膜 MAdCAM-1表达的影响进行定性及定量分析。 1 材料与方法 1.1 实验材料 清洁级 Sprague-Dawely 雄性大鼠 60 只，体重为 200±20g,购自上海斯莱克实 验动物有限责任公司。5 ％2 ，4 ，6 －三硝基苯磺酸（TNBs ）购自美国 Sigma 公司；无水乙 醇购自上海试剂一厂。参青方为口服结肠靶向制剂参青肠溶片的原料药，由上海家化医药科 767 技有限公司提供。美沙拉嗪肠溶片（惠迪）购于佳木斯鹿伶制药有限责任公司。 MAdCAM-1(mucosal vascular addressin cell adhesion molecule-1) 山羊抗大鼠多克隆抗体购自 美国 Santa Cruz 公司；蛋白抽提试剂盒（Sangon S-415），BCA 蛋白质定量试剂盒(Sangon S-430)，Sangon 化学发光试剂盒（Sangon S-420），生物素标记的蛋白分子量标准购自北京 天为时代生物科技有限公司。 1.2 方法 包括动物分组与模型制备、结肠粘膜组织MAdCAM-1 的标本制备及免疫组化检 测。 1.2.1 动物分组与模型制备 将 60 只大鼠随机分为正常组、模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、美沙拉嗪组、参青方低量组（简称参 低组）、参青方高剂量组（简称参高组）6 组，每组 10 只。除正常组 10 只大鼠以外，其余 50 只参考文献制备TNBs 诱导结肠炎大鼠模型[1，2] 。先将50 只大鼠腹腔注射氯胺酮2ml·kg-1 进行麻醉。参照文献报道[1]的TNBs 造模最佳剂量 100 mg/kg 计算，用 1 ml 注射器抽吸 TNBs 原液（0.20 ml/100g SD 大鼠），继续抽吸 0.25 ml 的 50 ％乙醇混合后，用改良后的大鼠直灌 胃针插入肛门上段约 8cm 后注入造模混合试剂。在造模后第 3 天处死模型Ⅰ组大鼠，并采 集结肠标本。于造模后 3 天开始，各组大鼠经肛门给药。各组给药剂量及浓度如下：美沙拉 嗪组：给予 600mg/kg/d，