从转录组与蛋白组水平对鲜冻精子基因表达差异的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四届学术研讨会论文集 从转录组和蛋白组水平对鲜冻精子基因表达差异的研究 王栋，朱化彬，陈龙，王永贵，韩伟东，柳强，郝海生，杜卫华 中国农业科学院北京笛牧兽医研究所北京100193 cDNA消减杂交文库，对文库进行了序列测定和部分数据的生物信息学分析，同时采用双向电泳技术方法对鲜冻精子全蛋白进行 了分离分析和比较，找到了一些在质和量上存在差异的蛋白点，以部分阶段蛀结果分析了冷冻对精子基因表达所造成的重要影 响。 关键调精子，冷冻损伤，转录组，蛋白组 精液冷冻保存和人工授精技术的发展避免了本交困难和疾病传播：同时减少了种公畜的饲养管理成本(减少 存和人工授精，其它家畜的精液冷冻技术却没有取得实质性进展(张德福等，2005)。然而，冷冻对各个物种的精子都 产生了不同程度的损伤，结果不同程度地降低了冷冻精子的受胎率，研究表明精子的损伤发生在不同的细胞水平和 基因表达的各个层面，即使是液氮保存期间损伤也在进行中，精子死亡和活力丧失不能够完全解释受精能力的降低 分子机理，本研究从转录组和蛋白质组学水平对这些冷冻过程中发生变化的生物大分子进行研究，同时为精子冷冻 保存和低剂量输精提供强有力的理论指导(张坚中，1988；朱士恩，2007；陈龙等，2008)。 1实验材料 1．1精液样本来源 选取北京市奶牛中心九头健康成年种公牛，采集其新鲜精液和同一批次的冷冻精液，并对其进行镜检，镜检合格 后进行后续的精子转录组和全蛋白质组学分析。牛睾丸、肝组织来自北京某屠宰场屠宰的健康公牛。 1．2主要试剂 2DC1eall 1(it、24clTlImmobilineTM Up硒t、2Dqmnt D呵Strip(pH3．10L)、线性口GBu脑r(pH3．10)、尿素、硫脲、 购自lIlvi仃og印公司；硝酸银、苯酚、氯仿、异丙醇等购自北京化学试剂公司；M—MLV反转录酶、DNaseI(RNaseFree)、 PCRcDNA 2PCR cDNA Sma酊M 酯)购自SIGⅣ【A公司；Super SyTlthesisKjt、Advamagekit、AdvantagePolyT∞rase M汊、PCR．selectTMcDNA Sub订action鼬t购自Clontech公司；pGEM—Teasy载体、E 2实验方法 2．1糟子计数及洗涤 将细管冻精40℃水浴解冻，鲜、冻精液分别进行精子计数，然后每个体分别取等量精液，每三个个体随机混池， 共制备3个鲜精池，3个冻精池，分别从每个精子池中取3．Ox 加入1ml0．25M蔗糖溶液振荡洗涤，120009，4℃离心10min。弃上清，重复三次。 2．2改进的热’rm刀ol法裂解精子细胞进行总m呵A和全蛋白质的制备 向经洗涤的3．0x107个精子沉淀中加入lml 65℃裂解精子细胞45 分为三层，RNA位于上层水相，DNA位于中间层，蛋白位于下层有机相。 小心吸取上层RNA水相至另DEpC处理的灭菌离心管；加入500u1异丙醇，再加入5ulRNA助沉剂，轻轻反复 燥2～3min，使乙醇完全挥发，加入20ul DNA酶对污染的基因组DNA进行消化，然后．20℃保存。 bu舵r，100W冰 次；无水乙醇重复洗涤蛋白3次；室温干燥后溶解于合适体积(约500IJL)样品水化液中，加入1％IPG 浴超声20n恤，4℃过夜溶解。 263． l ■■一 十m*‰§自々☆目％镕镕≠H☆*l。日Ⅷ￥{Ⅻi寸☆≈i女 PcR反商． 圈3对精于甚RH^丘转曩产物扩坩的PcR循环敦优化的幢嗣升析 ##d15—0：球鞘PcR循目数为I5～30K15鲜精P(_R循环