我国猪群中新甲型H1N1流感病毒生物学特性研究.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 我国猪群中新甲型 H1N1 流感病毒生物学特性的研究 孙怡朋，杨俊，刘金华 （中国农业大学动物医学院，北京，100193） 1 引言/ 目的 甲型H1N1 流感病毒不仅在人群中广泛传播，还在多个国家的猪群中被分离到。遗传进化分析表 明，甲型 H1N1 流感病毒很有可能起源于猪。猪被认为是流感病毒的“混合器”，甲型 H1N1 流感病 毒已被报道和猪群中的多种流感病毒发生了重排，包括欧洲类禽 H1N1 、北美三元重排 H3N2 和欧亚 H1N2 猪流感病毒（2,3,5 ）。因此，甲型 H1N1 流感病毒在猪群中的流行可能给公共卫生健康带来威 胁。在本研究中，我们对猪群中的甲型 H1N1 流感病毒进行流行病学调查，并且研究了分离猪的遗传 进化特点、受体结合特性和致病性。 2 材料方法 2.1 样本采集与病毒分离 研究团队于 2009 年 9 月到 2010 年 7 月在山东某屠宰场分离了 3000 份猪鼻咽拭子。拭子在冷藏 条件下运输到实验室。用涡旋震荡器震荡 15s，然后将棉拭子在瓶壁反复挤压后取出，3 000×g 离心 10min，取上清并置4 ℃过夜，次日接种于MDCK 细胞。72 h 后收获细胞培养液，测定细胞培养液对 1%鸡红血球的凝集活性。 2.2 遗传进化分析 利用 RNA 提取试剂盒（QIAGEN ）进行病毒 RNA 提取，利用特异性引物对各基因片段进行扩 增。所扩增片段经回收纯化后送华大基因公司进行序列测定。将测序结果进行拼接和校正，对核苷酸、 氨基酸序列进行系统、细微地分析，比较流感病毒抗原位点、受体结合位点、致病性关键性位点氨基 酸的组成。对序列拼接、校正和系统分析使用了 Chromas、DNASTAR 、DNAMAN 等软件，美国 LO SALMAMOS 国家实验室流感序列数据库ISD ，日本DNA 数据库 DDBJ ，以及NCBI BLAST 等生物 信息学工具。用 MEGA 软件制作遗传进化树。 2.3 HA-受体结合特性测定 利用剂量依赖性 ELISA 法测定病毒的受体结合特性，6’SLN：Neu5Aca2-6Galb1-4GlcNAcb-SpN H-LC-LC-Biotin 和 3’SLN：Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb-SpNHLC-LC-Biotin 分别结合 α2,3 和 α2,6 唾 液酸受体。 2.4 小鼠实验 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠购自北京维通利华公司，进行 MID50 、LD50 和病毒分离测定。BALB/c 小鼠经大腿肌肉注射舒泰麻醉后，将 50μL 相应滴度的流感病毒经鼻腔接种。每组 5 只 BALB/c 小鼠 分别接种 50μL 10 倍倍比稀释的病毒液，于 4dpi 处死小鼠，取肺脏做噬斑检测。用 Reed 和 Muench 方法计算 MID50 。每组 5 只 BALB/c 小鼠分别接种 10 倍倍比稀释的病毒液，每天称量体重直至 14dp i ，体重﹤25% 的小鼠记为死亡。用 Reed 和 Muench 方法计算 LD 4 50 。于4dpi 每组剖杀 3 只 10 pfu 攻 毒剂量的小鼠，测定病毒在鼻、肺、心、肝、脾、肾、肠、脑的复制水平，并对肺进行组织病理学观 察。 2.5 统计分析 实验的数据利用双因素方差分析来进行比较，组与组间的显著性比较采用 Tukey’s 检验来进行。 3 结果 442 猪的传染病 3.1 猪源甲型 H1N1 流感病毒的分离 本研究于 2009 年 11 月至 2010 年 7 月在山东省的屠宰场采集 3000 份鼻拭子，共分离到 6 株（0. 2% ）甲型H1N1 流感病毒。所分离的甲型 H1N1 流感病毒的各基因片段与人群中的 H1N1 流感病毒的 遗传进化关系相近，核苷酸与 A/California/04/2009 （CA04 ）的相似率为99.29-99.88%