稳定敲低SIGIRR的人肾小管上皮细胞的构建及其初步功能的研究.pdfVIP

安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2015Feb；50(2) ·129 · ◇基础医学研究◇ 稳定敲低 SIGIRR的人肾小管上皮细胞的构建 及其初步功能的研究 蒋克国 ，王德光 ，周海胜 ，查晓军 ，张桂霞 ，金福泉。，季 爽 ，潘海峰 ，叶冬青 ，郝 丽 摘要 目的 建立稳定敲低单免疫球蛋 白白介素 1相关受 斑狼疮 (systemiclupuserythematosus，SLE)最常见 体 (SIGIRR)基因的人肾小管上皮细胞株 (HKC)，并初步研 的并发症之一，而肾脏受累的严重程度对 SLE患者 究其功能。方法 针对SIGIRR基因的有效靶点设计 shRNA 死亡率及预期寿命有显著影响¨ 。但 LN发病机 序列，与 GV248一GFP—Puro慢病毒载体连接产生重组体 制 尚未完全明确。研究 提示 LN的发生和发展 (GV248GFP．Puro．shSIGIRR)。将测序验证正确的重组体与 与肾小管上皮细胞 内Toll样受体／白介素 1受体 包装质粒 (pMDL、pRey、pVSVG)共转染 293T细胞进行病毒 (Tol1．1ikereceptor／IL．1receptor，TLR／IL一1R)信号 包装 ，收集病毒并感染 HKC细胞。实时荧光定量PCR(qRT— PCR)和Westernblot法分析检测 HKC细胞 中SIGIRR干涉 通路的活化有关 ，核转录因子 NF．KB激活，产生趋 效率。应用白细胞介素一1B(IL一131)刺激成功敲低 SIGIRR的 化因子 [如单核细胞趋化蛋白一l(monocytechemotac— HKC细胞及对照细胞 ，Westernblot法检测其下游核转录因 ticprotein．1，MCP一1)、正常T细胞表达和分泌的活 子 NF．KB(065)的磷酸化水平 ，qRT—PCR分析单核细胞趋化 化调节蛋 白(regulateduponactivationnormalTcell 蛋白．1(MCP一1)、正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋 白 expressedandsecretedfactor，RANTES)]调节炎症 (RANTES)mRNA水平。结果 成功构建重组慢病毒载体 细胞向肾组织浸润和活化。有研究 I9提示单免疫 GV248一GFP—Puro—shSIGIRR。qRT—PCR和 Westernblot法均 球蛋 白白介素 1相关受体(singleimmunoglobinIL一1一 证实在 HKC细胞 中成功敲低 SIGIRR的表达。此外，IL一1B relatedreceptor，SIGIRR)对TLR／IL-1R信号通路起 刺激后 ，与对照细胞相比，敲低SIGIRR的HKC细胞 (HKC／ 负调控作用，因此有望成为LN治疗新的潜在的靶 shSIGIRR)的p65磷酸化水平上调 ，MCP一1和 RANTESmR— NA表达水平升高。结论 HKC的炎症反应中，SIGIRR蛋白 点。该研究 以人肾小管上皮细胞 (humanrenaltu— 对Toll样受体 ／白介素 1受体 (TLR／IL一1R)通路起 “刹车”作 buleepithelialcells，HKC)作为模型，构建针对 SI- 用。该研究为狼疮性肾炎的治疗提供了新的潜在的靶点。 GIRR基因的小发夹状 RNA (smallhairpinRNA， 关键词 狼疮性肾炎；人肾小管上皮细胞；SIGIRR；慢病毒载 shRNA)的慢病毒表达载体，包装成病毒感染 HKC 体；NF．KB；趋化因子