用液相芯片方法检测禽流感病毒H5N1+亚型研究.pdfVIP

分子生物学篇 用液相芯片方法检测禽流感病毒H5N1 亚型的研究 1 2 2 3 2 夏 骏 邓 菲 胡志红 刘 芳 王华林 1 浙江省人民医院检验中心 310014 2 病毒学国家重点实验室 中国科学院武汉病毒所 中国科学院分子病毒学 重点实验室 无脊椎动物病毒学联合开放实验室 430071 3 病毒学国家重点实验室武汉大学生命科学学院 430072 流感病毒引起的流行性感冒是常见急性呼吸道传染病之一 由于流感病毒极易变异 难以进行 预前的免疫预防 常常引起全国甚至世界性大流行 尤其近段时间世界上部分国家及我国部分地区 出现了突发的禽流感及人禽流感H5N1 亚型感染的病例 且还有随时发生大规模流行的可能 这些 情况都迫切要求对禽流感病毒H5N1 亚型能够做出早期 快速的实验室诊断 液相芯片 Multi-Analyte Suspension Array, MASA 作为一种新型低密度基因芯片技术 具有 高通量 灵敏度高 速度快的特点 本实验中我们利用液相芯片技术 设计针对 H5N1 血清亚型的 特异性引物和探针 通过使用荧光编码微球 beads 偶联的特异性检测探针来对 H5N1 亚型进行 快速的鉴定和分型 材料和方法 一 标本的来源和准备 1 标本的来源 本实验所使用的禽流感病毒毒株均由中国科学院武汉病毒研究所保藏中心提 供 并经过传统血清学方法鉴定和分型 2 RNA 提取 RNA 提取参照Invitrogen Trizol 试剂使用说明进行 提取出的核酸立即用于下 步操作 不能立即处理的置于–80 保存 3 主要试剂和仪器 引物和探针由上海基康生物科技有限公司合成 RT-PCR 一步法试剂盒 购自Qiagen 公司 羧基化微球 7 个/mL 购自Luminex 公司 偶联试剂EDC 1.25×10 1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺 购自 Pierce 公司 MES 2-[N-吗啉代] 乙磺酸 购自 SIGMA 公司 液 相杂交试剂TMAC 氯化四甲铵 购自 SIGMA 公司 SA-PE 购自Molecular Probes 公司 多功能 流式点阵仪购自Luminex 公司 二 序列分析 引物探针的设计合成 从NCBI 的GenBank 上下载所有A 型流感病毒H5 和N1 片段核酸序列 筛选出所需的完整序 列 利用生物信息学软件 Bioedit7.0.1 对序列进行比对分析 根据核酸的同源性将这些核酸序列 分成不同的组别 本实验中对H5 和N1 亚型分别分成两个分析组 H5-1 和H5-2 N1-1 和N1-2 对于每个组 分析并找出保守序列 根据保守序列设计引物和探针 由于单个核酸变异比较多 我们对变异位点 进行简并性设计 由于所使用的探针需要和羧基修饰的荧光编码微球进行偶联 所有探针都需要进 行5′ 端的氨基化修饰 设计引物时 在所有正向引物和反向引物的 5′ 端各加入一段独特序列 即与所有已知的流感病 毒序列及 GeneBank 中保存的数据没有同源性的序列 以便用于进行第二轮扩增反应 5′ 端各加入 的独特序列分别为Uni-forward 5-TAC AGT CGG TCG CGT GCC TC 和 Uni-reverse 5-CTG GTC CGT ACT TCC GAG CG 第二轮扩增反应使用上面的这两段序列做为上下游引物 Uni-forward 和 Uni-reverse 其中下游 引物Uni-reverse 的5′ 端用生物素 biotin 标记 597 最终设计引物和探针如图1 正向引物