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凝血酶及其受体在恶性胸腔积液中的表达研究 沈林峰* 周建英 浙江大学医学院附属第一医院呼吸科（310003） *杭州师范学院医学院附属余杭医院在职研究生 临床上恶性肿瘤在进展时，常出现包括胸膜腔在内的浆膜腔转移，且对放化疗和局部抗肿瘤治 疗效果不佳。迄今为止，有关恶性肿瘤进展与转移的机制尚未完全明确。一般认为，恶性肿瘤生长 转移的机制非常复杂，涉及到基质蛋白酶、多种细胞因子、细胞黏附分子以及相应的信号转导机制 和相关的基因改变，其机理有待进一步深入地研究。 早在 1865 年，Trousseau 就观察到恶性肿瘤有较高的静脉血栓发生率，但直到近20 年来，凝 血异常与恶性肿瘤相关的机制才被逐步揭示。在所有恶性肿瘤患者中，90%可发现有凝血异常，15% 的患者临床可检测到静脉血栓。有一项调查显示高达 25.6% 的肺癌患者罹患深静脉血栓。也有一些 研究提示，凝血异常与肿瘤的负荷、临床进展以及对化疗的反应相关。众多分子机制研究表明，恶 性肿瘤不仅激活凝血系统，反之，激活凝血蛋白亦能对肿瘤细胞产生分子效应，从而有利于自身的 进展和转移。分子效应的基础在于凝血酶（thrombin ）等凝血蛋白对肿瘤细胞表达的细胞膜受体的活 化。近年来，国外的研究发现，凝血酶，作为凝血系统酶级联反应的关键凝血蛋白，能够参与肿瘤 细胞的生长、凋亡、黏附、血管新生和转移过程，并且这一过程完全独立于其凝血生理作用。进一 步的研究发现，凝血酶的特异性受体——蛋白酶活化受体-1 （Protease-activated receptor-1 ，PAR-1 ） 在肿瘤细胞的增殖和转移中起到了关键的作用。已有大量的研究证实，凝血酶活化水平在恶性肿瘤 患者血浆中增高明显，而Schiller 等的研究初步提示，在恶性浆膜腔积液中凝血酶水平亦明显增高。 但有关恶性胸膜腔积液（milignant pleural effusion ，MPE ）中肿瘤细胞有无表达PAR-1 尚未见报道。 本研究通过分别测定恶性胸膜腔积液患者血浆和胸水的凝血酶－抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT ）水平比 较两者间表达水平有无差异，检测胸水局部凝血酶的活化水平，并同时检测恶性胸膜腔积液中原代 肿瘤细胞PAR-1 的表达，以证明原代肿瘤细胞能表达PAR-1 ，探讨凝血酶及其受体在恶性胸膜腔积 液患者中的肿瘤生物学效应。 研究对象与方法 一、研究对象 恶性胸腔积液组取自2005 年6 月～2005 年12 月在浙江大学医学院附属第一医院经胸水中细胞病 理学证实的肺癌伴恶性胸膜腔积液患者 10 例（未经化疗）。平均年龄72.5 岁（36～82 岁）。男性7 例，女性3 例。其中鳞癌2 例，腺癌8 例。按国际抗癌联盟（UICC ）肺癌TNM 分期：其中Ⅲb 期7 例，Ⅳ期3 例。对照组为同期在浙江大学医学院附属第一医院确诊的10 例结核性胸膜炎（患者（未 经化疗，取胸水标本）以及10 例健康体检者（取血清标本）。年龄及性别分布均匀，无统计学差异。 二、主要材料与试剂 1、TAT ELISA 试剂盒：Human TAT Complexes ELISA Kit ，Catolog No.ET1020-1 ，美国Assaypro 公司。灵敏度为400pg / ml ，其组内和组间变异系数分别为8.1%、6.4% 。 ·48 · 2 、RNA 抽提试剂盒：TRIzol ® Reagent ，Catalog No.15596-026 ，美国Invitrogen 公司。 3、引物：参照文献设计PAR-1 的引物。 Forward ：5’-CAGTTTGGGTCTGAATTGTGTCG- 3’ Reverse ：5’-TGCACGAGCTTATGCTGCTGAC- 3’ 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 4 、β-actin 内对照： 上游引物 P1 ： 5- AGC GGG AAA TCG TGC GTG -3 下游引物 P2 ： 5- CAG GGT ACA TGG TGG TGC C -3 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 5、琼脂糖：Agarose ，Catalog No.