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重组体分子的选择与鉴定方法及原理 重组体分子的选择与鉴定方法 我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个重 要环节。 涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。 常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。 直接筛选法 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。 间接筛选法 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。 重点介绍的筛选方法 遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。 常用的抗药性选择标记 A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。 b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。 a类筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。 a类筛选的实验方法 LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； 放在37℃培养箱培养12~16小时； 观察菌落生长情况。 抗药性标记法示意图 b类插入失活筛选 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。 例如： 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长。 B类插入失活筛选步骤 注意事项： （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间 约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。 （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。 遗传学表型筛选的方法二—a互补 基本原理： 这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。 所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物X- Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使b-半乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产