A1-1.小鼠纤维介素基因shRNA表达质粒的构建与体外RNA干扰研究.pdfVIP

大会发言 A1—1．小鼠纤维介素基因shRNA 表达质粒的构建及体外RNA干扰研究 湖北武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院(430030)汪之沫宁琴 罗小平 纤维介素蛋白(fibnnogen—like protein2，fgl2)又称fgl2凝血酶原酶，是新近发现的一种凝血因子， hetatitis 它通过直接激活凝血酶原启动凝血过程。f912凝血酶原酶最初是在感染鼠3型肝炎病毒(mllline virus 人类重症型肝炎的发生有关。对f912进行基因干预研究，将为进一步地探索重症肝炎基因治疗奠定基 础。 RNA干扰(RNA RNA， dsRNA)的导入引起目标基因不表达或减效表达，具有高效、特异、快速等优点，应用前景广阔。本研 hairpinRNA，shRNA) 究采用了一种独特的方法构建了针对小鼠最12(mfgl2)基因的小发夹RNA(short 表达载体，将其转染到CHO和Hela细胞，分析了对m融12基因表达的干预效果。 材料与方法 DNA聚合酶购自MBIFermentas公司，DNAmarkerDL2000购自大连宝生物公司，DNA凝胶回收试剂盒和 I和Hindm购自大连宝生物公司，T4DNA链接酶 质粒中提试剂盒购自Omega公司，限制性内切酶BmnI-I 公司。所有测序均由上海博弧生物公司完成。 人BamH 1酶切位点，下游引物(引物2)5’端引入HindⅢ酶切位点。以提取的鼠基因组为模板，通过 mfgl2shRNA，测序无误。对此T载体进行双酶切(BamH I和HindⅢ双酶切后再纯化) 列”，纯化后克隆人载体pMSCVneo(载体pMSCVneo事先同样经过BamH 得到最终的重组载体pMSCVneo—U6一mfgl2shRNA。 一49— 3．细胞培养和共转染：CHO细胞复苏后接种到24孔培养板上培养，当细胞汇合率达50％．70％ 进行。每组重复3次。 EGFP融合蛋白在CHO细胞中的表达情况，并拍照。 5．流式细胞仪器检测分析细胞荧光蛋白表达：收集每孔细胞，PBS洗涤两次后再用PBS重悬细胞沉 淀，用流式细胞仪在488nm激发波长下检测每孔细胞的荧光表达阳性细胞率“，计算抑制效率，抑制效 率=(未干预组n一干预组a)／未干预组a。 6．统计学处理：采用统计软件SPSSIO．0对数据进行Y2检验。 GAPDH做内参，PCR产物进行电泳，紫外灯下观察拍照。 24h，分别取各组细胞做出细胞爬片，进行n妇12的免疫组化染色。 结 果 ragl2的shRNA模板序列共366bp，经过酶切浏序鉴定无误。 后，倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达的变化。在此三个时间点均可见干预组较未干预组和非相关 干预组的绿色荧光强度明显减弱，荧光细胞数明显减少。转染72h后，流式细胞仪检测各组细胞荧光表 pEGFP—N2一mf912和pblSCVneo—U6P的非相关干预组a与未干预组无显著差异。 达水平与未干预组无明显差别。 4．免疫组化：在蛋白水平，干预组mfsl2表达水平明显低于未干预组，而非相关干预组的nffgl2表 达水平与未干预组无明显差别。 讨 论 Fgl2凝血酶原酶属纤维蛋白原相关蛋白超家族，具有丝氨酸蛋白酶活性。F援12凝血酶原酶基因在 人类位子7qII，23染色体，其产物的生物学活性类似于活化的凝血因子(xa)．可直接催化凝血酶原转 变成有活性的