可溶蛋白制备.docVIP

产品使用说明书 His·Tag融合蛋白纯化操作手册 采用pET系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到20mg/100ml培养基并不是困难的事。在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进行目的蛋白的细胞定位（请参考pET系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以通过选择不同表达载体和E.coli宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表达的目的。His·Tag?融合蛋白，可以在天然条件下、或变性条件下用NTA His·Bind树脂或IDA His·Bind树脂进行纯化。菌液体积始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采用一个较高的浓缩系数（concentration factor进行菌的裂解，较大培养体，按一定比例加入一定体积的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。 例如，某蛋白表达水平需要在变性条件下进行小批提纯则培养离心获得的菌体，按浓缩100倍比例重悬于含变性剂的裂解/结合缓冲液中。 非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难建议采用50-100倍浓缩。 表1 确定所需菌液体积 His·Tag融合蛋白浓度 表达水平 培养体积 His·Tag融合蛋白总量 浓缩系数在1ml溶液中裂解后 变性条件 50mg/40% 3ml 150μg 3× 10mg/L 8% 10ml 100μg 10× 2mg/ L 1.6% 25ml 50μg 25× 0.5mg/ L 0.4% 50ml 25μg 50× 0.1mg/ L 0.8% 100ml 10g 100× 天然条件 1mg/ L 1% 50ml 50g 50× 1mg/ L 1% 100ml 100g 100× 与其它亲和纯化介质一样，His·Bind树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌抽提物中目的蛋白的含量有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱SDS，Western blot，S·TagTM Rapid Assay，FREorksTM S·Tag Assay等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。BugBuster Master Mix是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme?溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式设计的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。 可溶蛋白制备 抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考Novagen的TB055操作手册中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。 用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更少），可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，1.5ml培养液采用300μl抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。 选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速转动搅拌器上孵育10-20分钟。 注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。 4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）的材料。 将上清转入另一个新试管