荧光定量PCR方法应用于布氏菌检测研究概述.pdfVIP

荧光定量PCR方法应用于布氏菌检测研究概述 张利 姜海 田国忠 朴东日 赵鸿雁 崔步云 中国疾病预防控制中心传染病所 布氏菌荧光定量PCR(Real—timePCR)是目 前一种发展迅速应用广泛的检测技术，本文就荧 氏菌不同种型之间特异性的缺失序列，主要有 光定量PCR在布病检测中的应用做一综述，主要 包括针对布氏菌的荧光定量PCR的引物和探针 或全部已知布氏菌种型区别开的多重PCR方法。 设计、布氏菌荧光定量PCR模板制备、荧光定量 设计多重荧光定量PCR的引物和探针，难度 PCR用于不同临床标本的灵敏性和荧光定量 远大于单纯设计布氏菌某个种的引物探针，不但 PCR不同方法及其各自的应用。 要考虑引物之间，探针之间以及引物与探针之间 的相互干扰，还要考虑荧光定量PCR的最佳扩增 l布氏菌荧光定量PCR引物和探针 选取好的靶序列然后设计引物和探针对荧光 定量PCR发挥其独特作用至关重要。设计优秀 合于传统PCR和荧光定量PCR的引物和探针，该 的探针可以检测出最少只有一个碱基差异的序 方法依靠7个单独的PCR反应，能将传统的布氏 列，进而显著提高反应的特异性。目前，用于检测 布氏菌核酸的荧光定量PCR引物主要源于编码 IS711等分别设计了布氏菌属和牛、羊、猪种布氏 OMP25、OMP31、BCSP3l、()MP2、16SrRNA、16S 菌的引物和探针，从而在属和种(限牛、羊、猪种) 一23S基因转录间隔区、per、ery等基因的序水平将布氏菌与其它细菌区分开。刘志国【l钉等在 列Ez-5]，而这些引物主要用于布氏菌属的检测。其William和李光辉等的基础上对引物和探针进行 中以根据BCSP31设计的B4、B5引物应崩较广。改进后建立了能在一个反应体系内将布氏菌属、 由于布氏菌各个种型之间同源性超过 牛和羊鉴别的多重荧光定量PCR，检测灵敏度最 90％[6]，使得区分布氏菌各个种的引物和探针的 设计难度增加。用于布氏菌种型鉴定的引物或探 量和荧光素种类有限和建立多重荧光定量PCR 针的设计主要有两种依据。一种是依据一个叫 体系本身的难度，所以在一个体系内能同时检测 IS71l(或IS6501)的插入序列，该序列在布氏菌的 布氏菌所有种型的报道尚未出现。 不同种型之间有不同的拷贝数和捕人位点[7]。目 不同的引物设计，检测灵敏度也大不相同，基 前用于布氏菌种型鉴定的无论是传统PCR还是 于16S一23SITS设计的引物效率明显高于基于 荧光定量PCR方法．其引物主要是依据IS711插 ITS 入序列设计而成。例如1994年bricker等[8]设计 在布氏菌基因组内有3个完全一样的拷贝，而后 的比较经典的区分布氏菌牛、羊、绵羊附睾、和猪 种的AM()S—PCR方法，其五条引物就是依据四 基因组内拷贝数较多的IS711设计的引物，其灵 个种的特异序列设计的四条引物再加一条依据 敏度高于根据besp31和per基因设计的引物。 IS711设计的公用引物。姜海等[9j(2009)评价了 2布氏菌荧光定量PCR模板的制备 此方法鉴定布氏菌种型的特异性和实用性，通过 检测从国内分离到的100株布氏菌，证实AM()S制备模板是进行荧光定量PCR的必备步骤， —PCR是一种快速有效的鉴定布氏菌种型的方 目前还没有统一的提取核酸的标准方法，而不同 法。William等u0J(2004)依据编码BCSP31和 提取方法对DNA的同收效率存在很大影响。