重组活性羧肽酶B的克隆表达和复性研究.pdfVIP

重组活性羧肽酶B的克隆表达及复性研究 李素霞11，张育坚!，夏文超1，龚毅2．袁勤生1 B，CPB，EC 前言：羧肽酶B(carboxypeptidase3．4．17．2)是一种含锌的胰外肽酶，特异的水解肽链C端 前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase 中，信号肽被切掉．得到不具酶活性羧肽酶原B(procarboxypeptiedaseB．pCPB)从细胞中分泌出来，然 后通过胰蛋白酶将其酶解为具酶活性的CPB和活性肽部分。由于CPB是一种蛋自水解酶，在体内以酶原 形式分泌，直接表达CPB可能会对表达系统产生影响，故考虑用酶原的形式表达，表达出的pCPB再进行 胰蛋白酶酶切获得具酶活性的CPB。 目前，商业及研究中使用的CPB均为从动物胰腺提取，价格昂贵，而且并不能完全去除其他蛋白酶。 对于羧肽酶的克隆、表达仅有一篇文献报道ll”J，但没有对重组羧肽酶B应用方面的报道。本研究用羧肽 步纯化后，每升可得28 5mg的重组CPB，与生物提取相比，具有价廉、无污染的特点。 1材料 RT-PCR 及ligationkit，Takara；RneasyMinikit，Qiaogen；ThermoscriptTM DEAE flow,AmershamPharmaciaBiotech oxidizedand sepharose…fast AB；Glutathione 装。 2方法 2．1pam基因的获得 用Rneasy 没计的特异引物pCPB．sl／pCPB．s2和pCPB．a做PCR，PCPB GAG a 5’—cGc CACTTTGATGGC…3’(含BamH 1酶切位点和编码N端9个proCPB的氨基酸)；pCPB 转化感受态细胞DH5ct，质粒小量抽提，测序，测序结果用BLAST 程序与Genebank上的大鼠胰脏来源的proCPB对照证实(http：／／www．ncbi．nlm．nihgov／pubmed／)。 2．2重组质粒pT7．473．pCPB的构建 限制性内切酶BamHI和Hind pCPB l和Hind111双 双酶切片段．与同样酶切的pT7．473连接，转化感受态细胞DH5a，质粒小量抽提，BamH l(DE3)。 酶切鉴定，鉴定正确的pT7．473．pCPB转化感受态细胞BL2 作者简介：车素蘑，幺，r稃师，博L研究牛 Teh(021ax：(021-mail：qsyuan@eeust．edu．cn 197 图1羧肽酶原B克隆质粒pMDl 8一T-pCPB2和表达质粒pT7．473．pCPB2示意图 2．3重组翦株的摇瓶表达 方法参照分子克隆实验方法…“】，挑取单菌落于5ml 菌过夜；过夜菌按1％接种于含250ml 诱导后2．5h，离心收集菌体。 2．4pCPB包涵体的溶解及变性条件下Ni--NTA柱亲和纯化 湿菌体，1}}j pH8．0，20mmol／L 用25％Triton，50mmot／L Tris—HCI，pH8．0洗涤，离心，再用50mmol／LTris．HCl，pH8．0，洗涤2次，离心， 包涵体用B液(100mmol／LNaH2PO“10mmol／L 蛋白流出(Bradford法)，用溶液D(100mmol／LNaH2P04，10mmol／L 再_}I{溶液E(100mmolFLNaH2P04，10mmol／