中药材分子鉴别新方法锚定引物扩增多态性DNA(APAPD)地研究.pdfVIP

第四届世界养生大会论文集 中药材分子鉴别新方法 锚定引物扩增多态性DNA(APAPD)的研究 黄璐琦 崔光红李欣唐晓晶 何希荣 中国中医科学院 中药研究所 摘要 目的：寻找稳定性好、可操作性强的分子鉴定新方法。方法：在充分吸取黜垤D优势的基 础上，对其季l物和退火温度进行了改选。以人参、谚洋参为倒遗行方法的攘索和验证。结果：辱l物Pg-碡36F 得到人参、西洋参及其9种伪品的多态性条带。对于人参、诗洋参的鉴别结果与文献鉴别方法结果一致， 并且具有更高的稳定性。结论：该方法具有简单易行、稳定性和重复性好、提供的信息量火等优点，是 一静极吴羲逢翡中药材分子鉴定兹方法，被命名为锚定季l耪扩增多态注◇NA(觚ebo耐确搬髅 Polylllo巾hismDNA，APIAPD)。 amplification 关键词锚定引物扩增多态性DNA分子鉴芳11人参西洋参 鲍关注，从1994年艘零cR蓠次用于人参、匿洋参豹鉴裂【1】以_来，已有艏篇穗关的摄道，赶抵姒PD【20锄， 星等其他方法【21彩】。方法的不断创薪在于对人参、西洋参基因组信息的逐步了解，其中MARMS具有高 度酶特异性，准确恢捷，但箕学|耪设计须建立在大整已知痔刭麓基础上。焉＆谨D以其不需预舞基因组 序列，操作简单快捷等优点得到了最广泛的应用，但黜心D存在的结果重复性欠健，易受到药材产地及 储存时间影响的缺陷限制了其在分子鉴别领域的应用【2郇。因此，探索简单易行，稳定性好、可操l乍性强 的分子标记方法是中药材分予鉴嶷研究的重点和难点。本文报道的新方法以黜谨D方法为基本原理，对 其引物和退火温度两个主要因素进行了创新，该方法简称为锚定引物扩增多态性DNA(AmchoredPrimer 翘攀|i莲c板潍＆l疆静啦ism蹦A，凇◇)。麸人参、嚣洋参建立了A融．PD方法，对英反应体系稳定栏、 不同材料扩增结果稳定性进行了广泛的考察，并结合文献报道MARMS方法进行了验证和比较，表明 脚D方法是一种极具前途的中药材分子鉴定新方法。 1．材料和方法 l。l材料 人参、西洋参及其伪品来源见表l。所有样品经中国中医科学院中药研究所黄璐琦研究员鉴定后， 存放于中网中医科学院中药研究所标本室。 1．2◇N度提取方法 采用改进的C旧法提取药材总DNA[25】。 1．3萼l物设计 异大的区域。人参、嚣洋参验证弓|物采耀S孰殛毽等震予人参鉴别的凇嬲S弓|物【2l】。萼|物由上海生 物工程有限公司合成。 ·288· 第四届世界养生大会论文集 1．霹K装扩增条件及优纯 u 2+1．5mM，dNTP PCR反应体系为25L，其中10mMTris-HCl(pH9．O)，50mMKCl，MgO．15IIlM， O。15p 嘲lU(Invi粕gell、P∞mega等)，P五mer 进行，所有觥D引物均先用待鉴定的典型药材(～般4个样晶)进幸亍弓|物筛选帮PCR条件的优化。 72℃延{孛l砖必Os，循环结束72℃延{孛5珏妇。将韪对正、伪晶产生多态性条带的弓|物逐渐提高遐火湿度， 消除非特异性条带，确定最佳反应PCR参数。扩增产物用2．O％的琼脂糖凝胶(含EB)在l×岖缓冲 液中电泳，SYNGD娓型凝胶成像系统下观察、拍照。 表1 人参、西洋参及其伪品来源 名称 一 学名 状态 来源 时间 收集人 人参 鲜品 吉林集安 瓣～，2 Pallaxgins％g 2003年李欣 人参(大马牙)1) P．酎nseng 鲜品 吉林集安 2003年李欣 3 人参(二马牙)1) Eg妇eng 鲜晶 吉林集安 2003年李欣 4 人参(黄聚)1) 登ginse簸鬈 鲜菇