重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA地研究Ⅲ.ELISA试剂盒的制造及保存期试验.pdfVIP

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 I I I．ELISA试剂盒的制造及保存期试验 吴延功徐天刚王志亮张喜悦王君玮宋翠平刘佩兰徐培莲宋芳 农业部动物检疫所 青岛266032 【摘要】对抗原包被板、酶标二抗、阳性血清、阴性血清和试剂盒的保存条件进行摸索，并组装成试 剂盒，试剂盒保存12个月结果稳定。本研究还对影响试剂盒生产和操作的几个问题进行了探索，为该试 剂盒的进一步开发和商品化奠定了较好的基础。 【关键词】猪繁殖与呼吸综合征，ELISA，试剂盒，保存期 的ELISA诊断技术的研究开发进行了探索，但至今还没有一种很理想的试剂盒用于生产中。进ELISA诊 断试剂盒虽然操作简便，准确性和灵敏度都好，但价格昂贵，进行PRRS血清学监测和大规模检测很多猪 场都承担不起这笔开支。我们利用PRRSV的N蛋白表达抗原建立了ELISA方法，在对该方法进行了标准化 工作研究的基础上，我们进一步开展了试剂盒的研制和产业化研究，并对试剂盒的保存期进行了深人细致 的研究。 1．材料 1．1平底聚丙乙烯酶标板：美国Labsystems公司生产。 1．2酶标抗体：为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，由Dako公司生产。 1．3酶标抗体保存液：购自PIERCE公司。按使用说明书将酶标抗体稀释到工作浓度。 1．4试剂瓶：由青岛易邦生物工程有限公司提供。 1．5血清：阳性血清和检测用血清样品是由农业部动物检疫所用健康猪制备的血清；标准阴性血清为 SPF猪血清，来自新加坡国立大学分子农业生物学院；本研究所用的阴性血清来自青岛市红岛镇一无猪繁 殖与呼吸综合征(PRRS)病史，并经检测无PRRS抗体的猪场。 2．方法 2．1酶标板的制备 按吴延功等研究的方法口将阳性抗原和阴性抗原隔行包被到ELISA板上，封闭后，分成五组。组l： 将封闭好的酶标板置50℃烘箱内烘干，置4：12保存备用；组2：将封闭好的酶标板置室温风干，置4℃保 存备用；组3：将封闭好的酶标板置室温风干，用真空包装机密封，置4c|C保存备用；组4：将封闭好的酶 标板置有紫外线的超净工作台内，室温风干，置4℃保存备用；组5：将封闭好的酶标板，加入含蛋白保 护剂的PBST，每孔20虬，置4。c保存备用。分别测定五种处理方法对ELISA板的影响，并分别测定保存 --——694--—— 期。 2．2工作浓度的阳性、阴性血清的制备 分别以不同的阳性和阴性血清配制成标准阳性血清， 标准阳性血清的标定以OD值和P／N值计算。 分别将配制成工作浓度的阳性血清和阴性血清， 置4c|C保存备用； 2．3工作浓度的酶标抗体的制备及保存期试验 将酶标抗体用0．01M 试剂盒检测，测定保存期。 2．4底物的保存期试验 个月、6个月，做ELISA试验，测其OD值。 2．5试剂盒的组装 底物A液(1瓶，6m1／瓶)，底物B液(1瓶，6 成试剂盒。在试剂盒的外包装上分别注明品名、批准文号、批号、用途、检测数量、保存方法、生产日期 和有效期。 将组装好的试剂盒分别置4。C、37℃保存，测定试剂盒的保存期。 2．6试剂盒的检验 2．6．1剂盒判定标准的检验及不同洗板方法对ELISA检测结果的影响 试剂盒中抽取4个试剂盒，分成2组测定88份阴性血清的阴阳性临界值。在其它程序均按说明书测定的 条件下，分别用自动洗板机和人工洗板的方法进行临界值的测定，临界值的计算方法参见吴延功的方法131。 2．6．2重复性试验 2．6．1批内重复试验 分析。 2．6．2批间重复试验 取4份抗体水平不一样的血清，在10个不同个工作日进行ELISA，对结果进行统计分析。 3．结果 3．15种酶标板的处理方法对ELISA测定结果的影响及酶标板的保存期试验 将制备好的酶标板分别用5种方法处理，置4。C保存，分别在一定的保存时间内检测。试验中我们共 我们选择了其中一份参考血清的S／P值列于表1中。 从表1可以看出，5种处理方法种以第3种处理方法最为稳定，而以第5种处理方法最不稳定。第四 种处理在保存过程中比较稳定，但用紫外线处理后似乎就影响了抗原的抗原性。 表1．用不同方法处理的酶标板的保存期试验 ＼＼组别 l 2 3 4