重组CHO-C28细胞染色体鉴定方法地研究.pdfVIP

重组CliO—C28细胞染色体鉴定方法的研究 张岩锐，段丽娟， 苟凝虹， 徐枫(兰州生物制品研究所 兰州，730046) 【摘要】分别采用五种不同条件鉴定重组CHO．C28细胞染色体。对其影响因素如用秋水仙素处 理时间的长短、固定液的使用方法等进行了试验，选择出了细胞分散好、染色体形态正常、边缘清晰、 便于鉴定的两种最佳条件。此方法操作简单、成功率高，适于CHO．C28细胞染色体鉴定。 【关键词】CHO—C28细胞；染色体；鉴定 【中图分类号】 【文献识别码】A 【文章编号】1005．5673(2006) 养过程中，细胞不发生变异至关重要。按《中华人民共和国药典2005年版三部》规定，细胞库(MCB和 WCB)和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，无其它细胞的交叉污染n1。染色体是 检定细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标…。染色体检查法也是重组 简便、稳定、可靠、易于操作，对CHO—C28细胞染色体检定的不同条件进行了探讨，报告如下。 1．材料与方法 1．材料 CHO—C28细胞 取5小方瓶培养24h生长旺盛、形态正常的CHO—C28细胞，此时相当于生长对数期，可得到足够 量的分裂中期细胞，分别标计为A、B、C、D、E。 1．2秋水仙素储备液 取秋水仙素0．49加人注射用水lOOml配制成o．4％的秋水仙素储备溶液，置4。C保存。 1．3固定液 将冰醋酸与甲醇以1：3(v／v)的比例配制，现用现配。 1．4 Giemsa染液 化后加甲醇33ml，将其均摇后保存在棕色瓶中。用时与pH6．8的磷酸盐缓冲液以1：9的比例配制。 1．5低渗液 1．5．1 1．5．2 收稿日期：2006．07．12；修回日期： 作者简介：张岩锐，女，(1963-)，医学生物工程师，主要从事疫苗检测及其相关研究。 一318— 1．5．30．075mol／L KCl低渗液称取O．569KCl，加注射用水溶解并稀释至100ml。 KCl三种液体在使用前均须置37℃预温。 上述MEM、EMEM及o．075mol／L 2．方法 2．1秋水仙素的使用 用生理盐水按1．10将秋水仙素储备液稀释后以1：100分别加入到A、B、c、D、E细胞培养瓶内， 37℃继续培养5h。 2．2消化细胞 倒弃细胞培养瓶内的培养液，分别各加入O．25％胰酶8ml，铺满单层细胞表面，待肉眼观察细胞面发白， 并出现针尖样小空隙，随即用吸管将细胞吹打均匀混悬，将其移人离心管内，800r／min离心5min。 2．3低渗 KCl低渗液5ml，分别用滴管轻 ℃预温的EMEM(Earle’s)低渗液5ml，E瓶加入37℃预温的O．075mol／L 打混悬，B、D瓶细胞不进行预固定。将各瓶细胞悬液经600r／min离心3min。 2．4固定 弃去各瓶内的液体，轻轻沿离心管壁加人5ml新鲜固定液，勿使细胞分散，室温放置30min。吸出上 置10rain，600r／min离心3min，弃去上清。 2．5滴片 各管分别加新鲜固定液0．5～lml，将沉积细胞微混悬，取一滴细胞悬液滴至一20℃预冷的载玻片一端， 倾斜，使细胞悬液迅速平展于玻片表面，置室温干燥。 2．6白片镜检 高倍镜下观察，‘大多细胞完整、中期分裂相细胞占多数、胞内染色体分散均匀，说明染色体制片成 功，否则重新制片。 2．7染色 温干燥。 2．8镜检 在光学显微镜高倍油镜头下读片计数。 3．结果 正常的CHO—C28细胞染色体为20条，显微油镜下，A、B、D瓶细胞染色体较少，不很清晰。C、 E瓶细胞染色体分散较好(见表1)，染色体溶于胞浆中，可以较为清晰的见到被染成紫红色的CHO—C28 间期细胞核以及分散在它们之间的许多中期分裂相。每个细胞几乎都有大号亚中部着丝点染色体(见图 1)，未发现染色体结构如裂隙、环状无着丝点断片、微小体等畸变，偶见个别为40条染色体(见图2) ．矿≯ 。，甏 媳∥