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蛋白质组学实验室流程 第一向 等电聚焦电泳仪 第二向 垂直电泳仪 自动图象扫描仪 全自动斑点采集仪 全自动酶解仪 菲尼根公司质谱仪（HPLC/MS 图5-4 正常肝细胞和肝癌细胞蛋白质组双向电泳差异表达谱 圆圈标记的点为两者的差异蛋白质，数字号码为蛋白质点在参考胶中的索引号。 蛋白质组研究的前景 蛋白质组与基因组的共同特点是从整体的角度进行研究。在生命科学领域中，随着蛋白质组研究技术的发展和成熟，蛋白质组研究必将与基因组研究互相补充，更完整的解释各种生命现象，更有效的进行疾病的诊断和治疗，推进21世纪的生命科学研究。 * 电泳技术 Electrophoresis 电泳: 指带电粒子在直流电场的作用下，在一定介质（溶剂）中所发生的向异性电极定向移动的现象。利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术叫做电泳技术。 一.基本原理 二.影响电泳的主要因素 1.电泳介质的PH PH：决定解离度 电荷量 Pr 、AA： PH距PI远 解离度大 电荷 V PH距PI近 解离度小 电荷 V 显微电泳 电泳 自由界面电泳 区带电泳 选择合适PH：使电荷差异尽量大 PH值恒定：缓冲液 2.缓冲液的离子强度 离子强度 缓冲容量 不易维持PH恒定 离子强度 压缩Pr双电层 电荷量 V 最适离子强度：0.02－0.2 3.电场强度 电场强度 V 电场强度 V 电场强度 电流 热量 导致Pr变性 发热 缓冲液水分蒸发过多 离子强度 虹吸现象 较高电压 冷却装置 4.电渗：液体对于固体的固定相相对移动，成为电渗。 相反：电泳的实际距离＝电泳的距离－电渗的距离 相同：电泳的实际距离＝电泳的距离＋电渗的距离 三.区带电泳的分类 1.按支持物的物理性质分类： （1）纸电泳 （2）粉末电泳 （3）凝胶电泳 （4）缘线电泳 2.按支持物的装置形式分类： （1）平板电泳 （2）垂直板电泳 （3）垂直柱式电泳 （4）连续液动电泳 3.按PH的连续性分类： （1）连续PH电泳 （2）非连续PH电泳 四.电泳的用途 （1）分离各种有机物和无机盐 （2）分析某些物质的纯度 （3）分子量的测定 五.常用的电泳技术 （一）醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速等优点，电渗作用虽然较高但很均一 ，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10～100μm），样品用量很少，不适于制备。 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理： 二 .琼脂糖凝胶电泳 优点：①琼脂糖含液体量大，可达98％～99％，近似自由电泳，但样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微；②琼脂糖作为支持体有分辨率高、重复性好；③电泳速度快；④透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；⑤区带可染色，样品易回收，有利于制备。 缺点：琼脂糖中有较多硫酸根，电渗作用大。 用途：分离血浆脂蛋白、分离、鉴定核酸，如DNA鉴定、DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段 。 CM β脂蛋白 前β脂蛋白 α脂蛋白 三 .聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.聚丙烯酰胺凝胶的制备 2. 凝胶适宜孔径 3.缓冲系统 4.聚丙烯酰胺盘状电泳 浓缩效应 电荷效应 不连续盘状电泳 电荷效应 连续盘状电泳 分子筛效应 分子筛效应 不连续盘状电泳分离血清蛋白质原理： a.浓缩效应（在样品胶和浓缩胶中进行）： 有效迁移率＝迁移率×解离度 b.电荷效应 c.分子筛效应 5.聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 （四）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS：十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。另外在实验中，还要加入强还原剂，例如巯基乙醇或二硫苏糖醇则能使蛋白质分子肽链中的半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链能与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，1克蛋白质能结合1.4克的SDS，由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的，约为1.8nm。但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种复合物