虎眼万年青总皂苷对诱发大鼠肝癌病变过程中肝组织IGF-2及P16ink4a影响_药学论文.docVIP

虎眼万年青总皂苷对诱发大鼠肝癌病变过程中肝组织IGF-2及P16ink4a影响_药学论文 虎眼万年青总皂苷对诱发大鼠肝癌病变过程中肝组织IGF-2及P16ink4a影响_药学论文 作者：金星林，崔刚，千昌石，杜希臣，吴艳玲 【摘要】 目的动态检测虎眼万年青总皂苷对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中IGF-2及P16ink4a表达的影响。方法二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌变，虎眼万年青总皂苷干预，运用实时定量PCR法检测并分析第14周末预防组、模型组及18周末治疗组癌旁组织、癌组织、模型组癌组织标本中IGF-2及P16ink4a的表达。结果肝癌变模型组18周癌组织中IGF-2表达最高，与正常组、14周末预防组、模型组、18周末治疗组癌旁组织及癌组织间比较均有统计学意义（0.05）。肝癌变模型组18周癌组织中p16ink4a表达最高，与正常组、14周末预防组、模型组、18周末治疗组癌旁组织间比较均有统计学意义（0.05）。治疗组癌组织与模型组18周癌组织间无统计学差异（Pgt;0.05）。结论二乙基亚硝胺诱发的肝癌组织中IGF-2及P16ink4a表达水平增高，而虎眼万年青总皂苷具有干预肝癌组织中IGF-2、p16ink4a表达水平。 【关键词】 虎眼万年青总皂苷； 二乙基亚硝胺； 肝； 实验； IGF-2； P16ink4a 二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达众多基因中，以胰岛素样生长因子2(IGF-2)、p75NTR关联细胞死亡执行子ADE、细胞周期依赖性激酶抑制基因(pl6Ink4a)与肿瘤的关系尤为突出［1］。虎眼万年青Ornithogalum caudatum Ait为百合科多年生球根植物，民间全草入药，用于抗炎症、抗肿瘤等治疗。虎眼万年青皂苷（OSW-1）抗P338淋巴细胞白血病活性，是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍［2］。由于OSW-1提取、合成工艺复杂且较昂贵，给广泛的实验、应用研究工作带来一定困难。为了进一步开发和利用虎眼万年青植物，本实验应用虎眼万年青总皂苷检测对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中IGF-2 和P16ink4a表达水平的影响。 　　1 材料 　　1.1 药物提取 　　取植物虎眼万年青，在自然条件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡24 h，纱布、滤纸过滤后，收集滤液，滤渣继续加入乙醇浸泡，同上方法循环 3次，收集滤液，将3次所得滤液合并。滤液经减压浓缩为原来体积的1/5，再用1/3体积的石油醚萃取脱脂，保留水相，再次减压蒸馏后，加水稀释上AB-8柱吸附，反复吸附3次，6～8倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积95％乙醇洗脱皂苷。所得皂苷洗脱液，经D-280柱脱色后，减压浓缩后蒸干，即为虎眼万年青总皂苷。 　　1.2 实验动物及设计 　　雄性Wistar清洁级大鼠30只，体质量130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。动物适应3 d后开始实验。正常组：整个实验过程中均饮用灭菌自来水及基础饲料，并于18周末宰杀6只。模型组：每日给予基础饲料同时，用灭菌自来水配制浓度为95 μg/ml的二乙基亚硝胺(DEN)溶液（美国Sigma公司，避光保存，新鲜配制)，供大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95 μg/ml的DEN溶液。并分别于饲养第14周末、18周末分别宰杀各6只。肝硬化预防组：于实验开始在肝癌模型建立的同时, 根据预实验小鼠虎眼万年青总皂苷的LD50为3.2g/kg, 以接近于LD50之1/30的剂量，即相当于100mg/kg的给药浓度，以蒸馏水制成所需浓度的混悬液,每日灌胃并于14周末宰杀6只。肝癌治疗组：第14周后从模型组中随机选出6只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100mg/kg，并于第18周末宰杀。 　　1.3 取材及处理 　　各组大鼠宰杀前禁食12h，称体质量,乙醚麻醉后, 解剖腹腔，取肝组织，出现癌灶者取肉眼癌结节及距癌灶边缘0.5～1cm癌旁组织约50～100mg样品,生理盐水冲洗,液氮快速冷冻,并置-70℃冰箱,待统一检测。 　　1.4 试剂及器材 　　TRIZOL试剂、无RNA酶的水、无RNA酶的糖原（Invitrogen life technologies）；氯仿、异丙醇、100%乙醇、乙酸钠、甲醛（上海化学试剂有限公司）；Tris-HCl、EDTA 、MOPS、溴化乙锭、2.5 mM dNTP混合液、100 bp DNA Ladder（华美生物工程公司）；RNA酶抑制剂；MMLV反转录酶；5xRT缓冲液（上海生工生物工程有限公司）。DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）；Fer