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蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定_药学论文 蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定_药学论文 作者：金维维，赵钟兴，刘旭辉，罗贞钰，张蕾，韦俏娜，廖丹葵 【摘要】 目的建立蚕蛹蛋白氨基酸含量的测定方法。方法采用柱前衍生反相高效液相色谱法。结果在给定的色谱条件下，18种氨基酸在35 min内获得了较好的分离，在一定浓度范围内，氨基酸的峰面积与浓度的线性相关系数在0.990 6～0.999 8之间，相对标准偏差为2.02%～5.45%(n=5)。并测定了蚕蛹蛋白中氨基酸的组成和含量。结论该方法准确可靠、重复性好，可用于蚕蛹蛋白中氨基酸含量的测定。 【关键词】 蚕蛹蛋白; 氨基酸; 高效液相色谱法 　　Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of amino acids in proteins of silk worm. MethodsA reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of amino acids was described. ResultsThe mixture of 18 kinds of amino acids was characterized by HPLC in 36 min. The response was linear for all amino acids with a correlation coefficient of 0.990 6～0.999 8, method precisions (n=5) for the different amino acids were between 2.02%～5.45% (relative standard deviation, RSD). Using this method, 18 kinds of amino acids in protein of silk worm were determined. ConclusionThe method is accurate, reliable and repeatable for the determination of amino acids in proteins of silk worm. 　　Key words：Protein of silk worm; Amino acids; HPLC 　　蚕蛹(Bombyxmori L.)作为药用在我国有悠久的历史。现代研究表明，蚕蛹具有较高的营养价值，其中蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质，不仅含有人体所需的8种必需氨基酸，且氨基酸配比均衡性好，国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品[1]。因此测定蚕蛹氨基酸组成，对以蚕蛹蛋白为原料进一步开发功能产品具有重要的参考价值。 　　目前，对氨基酸的测定除采用氨基酸自动分析仪外[2]，柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸的技术也得到了很大的发展，且具有快速灵敏、不需专用仪器等优点[3]。高效液相色谱法分析氨基酸时常用的柱前衍生试剂如OPA(邻苯二甲醛)、DANSYL_Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和PITC(异硫氰酸苯酯)等各有优点和缺陷[4～6]。其中因为OPA 衍生步骤简单, 反应速度快, 剩余试剂不干扰测定, 衍生物可用紫外、荧光或电化学检测器检测，故其应用最广，但由于不能和仲氨酸反应，而FMOC 能与仲氨酸反应，因此将OPA-FMOC联用可克服两者单独使用时的缺点。本实验以OPA及FMOC为柱前衍生化试剂，利用二极管阵列(DAD)在同一通道用338 nm 和262 nm 双波长检测, 同时检测样品中的一级和二级氨基酸，建立了蚕蛹蛋白质氨基酸分析的方法。1 仪器与试剂 　　Agilent1100高效液相色谱仪，配四元泵及真空在线脱气机，美国安捷伦科技有限公司产品;CSF-1型超声波清洗器，上海超声波仪器厂产品;101AS-2型电热恒温干燥箱，上海实验仪器有限公司产品。 　　18种氨基酸标准品、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为进口分装产品;3-巯基丙酸(3-MPA)由Alfa Aesar公司，邻苯二甲醛，醋酸钠，三乙胺等为国产分析纯，上海国药试剂有限公司产品;甲醇，乙腈，四氢呋喃为色谱纯，天津四友色谱试剂厂产品。 　　2 方法 　　2.1 试剂配制流动相A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(含0.5%四氢呋喃及0.3‰三乙胺，pH=10.3)，0.45 μm滤膜过滤，备用;流动相B：甲醇;流动相C：乙腈。衍生剂A(OPA试剂)：取270 mg OPA试剂，溶于2ml无水乙醇中，加入100 μl 3-巯基