生化文献阅读.docVIP

文献阅读报告 作者： 专业：分析化学 学号：201 时间分辨色氨酸荧光探测在PAS域蛋白LOV2和PYP中的光诱导活化动力学 正文部分： 研究背景 LOV11和LOV2光素的光传感领域，一类蓝光控制趋光性，光诱导气孔光强度的变化。LOV域PAS域超家族的成员黄素单核苷酸（FMN）的辅助因子。这将C-末端激酶结构域自身磷酸化下游信号导是的。 暗态的LOV域，LOVD450，有其在450nm处。当吸收蓝光，FMN生色5ns内通过系统间交叉从激发单重态三重态660nmLOVL660。三重态衰常数为4μsLOVS390在390nm有吸收。在这个过渡是FMN和保的半胱氨酸巯基之间形成的一个共价加合物。LOVLOV域的信号状态，它的形成蛋白质的构象变化。它恢复到基态时，时间常数分钟。在其构象变化发生，但瞬态吸收光谱没有检测到。在燕麦LOV2-JR光活化两性的R-螺旋（JR）离解和局部展开两性的R-螺旋（JR）LOV2域C-末端在黑暗中LOV2核心中央的β-折叠。但是这些时间和解释仍然不清楚。在LOV2JR色氨酸W491和W557的光致结构变化由1H/15N NMR光谱检测。在黑暗中的两个色氨酸是在不同的;在光活化状态变化变得更加类似。回到他们的黑暗位置恢复具有相同的动力学。色氨酸的吲哚侧链也很强的荧光，并提供了一个天然的的荧光标记。此外，色氨酸荧光的环境的极性很敏感，它提供了一个合适的信号构象.NMR谱已经表W491和W557进行构象的变化，但无法解析其动力学的形成。因此，这是显然值得尝试色氨酸荧光动力学的信号状态。时间分辨荧光已被用于化学弛豫动力学。色氨酸荧光例如遵循蛋白质折叠的纳秒到微秒时间尺度激光诱导温度跳跃后。它最近表明，瞬态荧光光谱仪提供了一种敏感信号光感受器动力学一个短的激光闪光。时间分辨率为100 ns这种方法是适当的解决LOVS390中间寿命所发生的构象转变。准备两个突变体确定哪些色氨酸残基贡献到的荧光信号。在PAS-核心变异体结构中含W491491位上是色氨酸的结构，但是不含JR螺旋部分参看图。 在 W557S 变异体中含有JR螺旋部分和W491 (用only是因为557变异为丝氨酸，不再是色氨酸 ） PYP是一个相关的相似的结构PAS域。事实上，PYPPAS结构域超家族的结构原型。在构象变化形成信状态，这已经结构和动力学方法。这种结构闪光激发后约1毫秒发生变化，类似于在LOV2-JR会发生许多方面：N-末端帽它包含了两个短的R-螺旋，从中央分离β-折叠和展开。 PYP包含一个单一的色氨酸残基W119这中央β-折叠。其光中的各种中间体的显着不同。为了比较与LOV2-JR因此，我们也测量PYP色氨酸荧光和其温度。这使我们能够确定PAS结构域蛋白质信状态形成的活化能值。 实验方法 制备： LOV2-JR域大肠杆菌中，通过钙调蛋白亲和色谱法纯化（Stratagene公司），并冷冻干燥。在使用之前，干燥的蛋白质再悬浮于缓冲液中（10mM Tris，30 mM的氯化钾，pH值7.5）。LOV2-JR融合的完整序列蛋白质包含了三个色氨酸W491，W557，结合钙调素连接在的LOV2域的N-末端，并允许纯化的蛋白质。实验也包含His标。的结构钙调蛋白标。包含His标签的结构只有两色氨酸，W491和W557。W557S（氨基酸404-567）和一个核心突变（氨基酸404-521），其中已删除JR螺旋 瞬态荧光光谱：瞬态荧光时间分辨吸收光谱进行了设置色氨酸荧光LED以10nm半峰宽在280 nm处发射发射由一个光电倍增管（PM）检测，和样品20 ns的闪光在460nm处从一个染料激光器（香豆素102溶解在乙醇中）由XeCl准分子准分子激光（EMG50 LAMBDA物理）泵送100 ns至秒时间过程信号被记录。 PM受LED偏离光和激发闪光，过滤器WG305UG11（包括肖特）被放置在PM前面。在色氨酸稳态荧光时间过程在光活化期间被记录。该比色皿放置在一个恒温的样本保持器。在紫外可见波长区域，从245395 nm和680?775 nm的它是透明的。较低的波长带通色氨酸发射匹配，上一个色氨酸闪光灯将通过LOVL660的磷光光谱红边。要分开两种发色团信号贡献，我们进行了一项对照实验中测量LOV2-JR瞬态荧光一个附加的彩色滤光器（OG590）光电倍增管前面.这种设置，只有光在从680至775的波长区域有助于信号（参看图3B）。 瞬态荧光信号被定义为荧光强度F在激光闪光时间t后，和初始荧光F0闪光在t = 0前除以F0：ΔF/F0（T）=（F - F0）/ F0 =（I（T）I0）/ I0。光循环t = 0时的激光闪光。它是从相应光电倍增管的电流（I（t）的，I0）计算。若要计算对照实验中的瞬态信号，我们前用荧光强度F0的样品的在光束中放置