淀粉酶活的测定.docVIP

α－淀粉酶活力的测定 ? 一、实验目的 通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。 二、实验原理 α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。 三、实验试剂和仪器 （一）试剂 1. 原碘液 称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 2. 稀碘液 吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。 3. 20g／L可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。 注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。 4. 磷酸缓冲液（pH6.0） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。配好后用pH计校正。 （二）仪器 1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定 2. 秒表 3. 恒温水浴（60±0.2）℃ 4. 试管25mm×2000mm 四、实验步骤 1. 待测酶液的制备 称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。 2. 测定 （1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。 （2）加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻记时，摇匀，准确反应5min。 （3）立即吸取反应液1.00mL于稀碘液5.00mL中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度（A）。根据其吸光度查表，求得测试酶液的浓度（C）。 五、实验结果整理 样品酶的活力根据以下公式计算： X=c×n 式中：X－样品的酶活力[IU/g(IU/mL)] c－样品酶液的浓度(IU/mL) n－样品的稀释倍数 所得结果表示至整数。平行实验相对误差不得超过2%。 本文研究了麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖等作为碳源在不同浓度下对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细胞生物量及其培养基pH值的影响。结果表明:乳糖浓度为3%时,酶活力最高,为90.6±0.7U/mL。麦芽糖浓度为2%时,酶活力最高,为67.2±0.6U/mL;果糖浓度为4%时,酶活力最高,为38.0±3.7U/mL;葡萄糖浓度为4%时,酶活力最高,为23.2±0.3U/mL;蔗糖浓度为4%时,酶活力最高,为24.7±0.5μ/mL。枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶可能受乳糖的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用。发酵液前后的pH值没有显著的差异。细胞生物量也差别不大。该研究为进一步提高枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶酶活,提供了实践及理论意义。α-淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,其系统名称为α-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,是一种内切淀粉酶。它可以随机的方式切断淀粉分子内的α-1,4葡萄糖苷键,生成糊精和还原糖。α-淀粉酶是目前世界上较早生产、产量较大的工业酶制剂之一,在食品、纺织、医药和饲料等工业中都有 1．底物浓度 除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10～20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。 2．酶浓度 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S][E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。 3．温度 不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示。温度系数指温度每升高10，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l～2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温