马尾松花粉多糖硫酸酯化前后对小鼠脾细胞钙离子的作用及机理探讨.pdfVIP

马尾松花粉多糖硫酸酯化前后对小鼠脾细胞钙离子的 作用及机理探讨 耿越囊刘媛 (山东师范大学生命科学学院山东省抗性生物学重点实验室 济南250014) 披要：目的：研究马尾松花粉多糖硫酸酯化前后对小鼠脾细胞内游离钙离子的影响及作用机理探讨．方法：应 用特异性钙离子荧光探针Fura2-am测定细胞内游离钙离子浓度。观察马尾松花粉多糖硫酸酯化前后对 小鼠脾细胞内游离钙离子浓度的影响．结果：马尾凇花粉多糖经硫酸酯化后可显著提高脾细胞内钙离子 浓度，而酯化前作用不明显．特异性L型钙通道阻滞剂维拉帕米可部分抑制酯化多糖促钙离子升高的作 用．在外钙为零时，酯化多糖仍可小幅度提高脾细胞钙离子浓度． 关键词：多糖硫酸酯，脾细胞，游离钙离子，Fura2-am 多糖是自然界含量最丰富的物质之一，具有复杂的生物活性和功能。近10年来 发现，多糖的衍生物尤其是硫酸酯化多糖具有独特的作用，已成为多糖化学修饰研 究中的一个热点。本实验以马尾松花粉多糖(PPM)为研究材料，进行硫酸酯化，得 到硫酸酯化多糖(S—PPM)，然后研究两种多糖对小鼠脾细胞内游离钙离子浓度的影 响并初步探讨其作用机理。 1．材料 1．1实验材料 马尾松(Pinus 胞。 1．2实验试剂 毗啶、无水甲酰胺(天津大茂化学厂)，氯磺酸(中国医药上海试剂厂)，明 胶(上海化学试剂)，硫酸钾、氯化钡(天津天河化工厂)，RPMI1640(Gibco)， 小牛血清(杭州四季青)，Fura2-am(dojin)，Triton l)注射液 维拉帕米(verapami 1．3实验仪器 紫外可见分光光度计(北京普析通用)，双波长荧光分光光度计(CaryEclipse， TCS 美国)，激光共聚焦显微镜(LeicaSPE，德国)。 2．实验方法 2．1马尾松花粉多糖硫酸酯化11l 2．1．1磺化试剂的制备取40 IIIL吡啶置于烧杯中，冰盐浴，在搅拌条件下缓 慢加入40 mL氯磺酸，控制滴加速度使温度保持在室温以下，得白色粘稠物质，供 磺化使用。 2．1．2硫酸酯化取2gPPM，置于140 rain， mL无水甲酰胺中，室温搅拌10 然后逐渐加入酯化试剂，45℃下搅拌反应4h。 2．1．3脱氨和纯化冷却后，2．5 tool·L-1NaOH中和脱氨，至中性后，将溶液移 入透析袋，流水透析3天，三蒸水透析l天，充分清除小分子物质，加入3倍体积 95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀加无水乙醇、丙酮、乙醚 干燥，称重。 2．2硫酸酯化多糖的鉴定12l 以梯度浓度的硫酸钾作为标准物，做两个平行组(A、B)，其中A组加入氯化 mL：B 钡一明胶溶液(O．5％氯化钡，O．5％明胶)0．625mL及三氯醋酸(8％)0．87 组中用明胶溶液代替氯化钡一明胶溶液。室温静置20min后，测定360rim处光吸 收值，以两组光吸收值之差(A—B)对硫酸基浓度做标准曲线。精确称量PPM和S-PPM 各3 IIlL浓度为1 h， mg，分别溶于3 mol·L_的HCl溶液中，封管，100℃水解6 取O．1札稀释到lIIlL进行样品分析，操作同标准曲线。 取代度公式：伊(1．62×回／(32-1．02×53，S为样品中硫的含量。 2．3脾细胞钙离子测定 2．3．1脾细胞的分离无菌条件下剖开小鼠，腹腔取脾，D-Hank’S液冲洗，研 磨过200目筛网，收集脾细胞悬液1000rpm离心5min。弃上清，加红细胞裂解液 10ml，混匀脾细胞，静止4—5min，待红细胞完全破碎，1000