靶向沉默SENP-1基因应用于NHL基因治疗的初步探讨.pdfVIP

靶向沉默SENP．1基因应用于NHL基因治疗的初步探讨 同济大学医学院附属同济医院血液科梁爱斌 非霍奇金淋巴瘤(NHL)是常见的原发于淋巴组织的恶性肿瘤，目前发病率 已超过多发性骨髓瘤及白血病。成为血液系统发病率最高的肿瘤。反复多次化疗 后肿瘤细胞出现多药耐药以及肿瘤细胞产生对抗由抗肿瘤药物诱导的凋亡作用． 使化疗难度加大。因此加强其分子机制的研究寻找与其发生，发展、全身浸润及 形成耐药的相关机制．是探讨NHL治疗的新途径重要途径。 modifier 类泛素蛋白酶-1(smallubiquitin-likeprotease1，SENPl)通过 要作用。目前．国内外对SENP．1介导的去SUMO化的研究集中于在肿瘤细胞中 抑癌基因、转录因子以及信号转导途径中的作用，其中对SENPl-*HIF．1a— VEGFMDR一细胞存活耐药途径的研究较为深人，即SENP．1蛋白表达的增加会 上调HIF．1a蛋白稳定性，进而影响细胞在缺氧环境中的适应性反应。 本研究目的为明确SENP．1在淋巴瘤细胞生物学过程中的作用，并对可能 机制进行探讨．为后期应用相关技术进行以SENP．1为靶点进行NHL分子靶向 治疗、改善NHL预后提供实验依据。 1．SENP．1在NHL组织中的表达 目的探讨SENP．1表达与NHL的相关性。 方法收集16例NHL组织、5eq淋巴瘤反应性增生组织。培养人T淋巴瘤细胞 组织的表达．荧光定量PCR法检测SENP．1mRNA在细胞株中的表达并傲相对定 ■。 结果免疫组化结果显示。SENP．1特异性表达于肿瘤细胞中。外周T-NHL 中表达程度高于B-NHL，在侵袭程度高的类型中表达也较高。如Burkitt淋巴瘸： (P0．05X 结论SENP．1异常表达与淋巴瘤发生、发展可能有密切关系．有可能作为评 价淋巴瘤恶性程度和临床预后的重要指标。SENP．1在NHL肿瘤细胞高表达．提 示干扰其表达可产生较强的细胞生物学特性改变。是RNA干扰用于NHL肿瘤基 因研究的一个潜在靶点。 2．RNAj干扰技术构建稳定的的淋巴瘤细胞株 目的建立稳定的SENP．1基因沉默的Jurkat、Daudi淋巴瘤细胞系。 方法通过shRNA载体表达技术，构建了三组SENP．1一shRNA重组慢病毒， 标记为SHl、SH2、SH3。捋病毒转染至2株人淋巴瘤细胞系。荧光定量PCR及 westernblot法检测干扰效率。 SENP．1基因水平抑制率最高，分别为83．24％。79．17％。westernblot结果示相 应细胞SENP．1蛋白被抑制。 结论应用RNAi技术构建的SENP．1沉默的细胞株可应用于后续试验。 3．RNA干扰SENP．1表达对淋巴瘤细胞生物学特性影响 括细胞凋亡、增殖在内等细胞生物学特性的影响。 方法流式细胞仪测凋亡技术检测正常细胞(Jurkat、DaudiX空质粒转染 27 术绘制各组细胞增殖曲线、CCK．8药物毒性实验及流式测凋亡技术检测三组细胞 对抗肿瘤药物阿霉素敏感性的变化。 结果结果显示。与正常和NC．shRNA处理组相比。干扰组细胞自发凋亡率 增加。干扰组细胞的生长曲线明显压低．细胞生长趋势显著减慢。干扰组细胞对 药物敏感性增加，而对同一浓度阿霉素则凋亡比例增加。 结论RNA干扰SENP．1表达能增加细胞自发凋亡率．并且细胞生长趋势明 显放慢，另外使得细胞对药物的敏感性也增加。表明SENP一1有可能成为一个具 有潜在应用价值的NHL基因治疗靶点。 4．RNA干扰SENP．1表达对Jurkat细胞HIF．1a及其下游基因表达的影响 SENP．1对淋巴瘤细胞HIF．1a及其下游基因表达的影响．进一步探讨SENP．1在 淋巴瘤细胞发生、发展中与相关基因相互作用的分子机制。 Sh．SENP．1．Jurkat组细胞24h．荧光定量PCR及westernblot法检测HIF．1a基 因及蛋白水平的表达。荧光定量PCR法检测HIF．1a蛋白下游基因VEGF、MDRl、 survivin的表达。 结果三组细胞经低氧诱导后HIF-la基因水平均未增加(FbO．05k而经过 X实 survivin等