同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光 PCR方法.pdfVIP

第３３卷　第２期 应 用 海 洋 学 学 报 Ｖｏｌ３３，Ｎｏ２ 　２０１４年５ 月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｙ，２０１４ 同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重 ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ探针实时荧光 ＰＣＲ方法 郭书林 ，陈信忠 ，肖懿哲 ，朱苏琴 ，龚艳清 ，杨俊萍１ １ ２ ２ １ １ （１．厦门出入境检验检疫局，福建 厦门３６１０２６；２．福建省莆田市水产研究所，福建 莆田３５１１００） 根据包纳米虫（Ｂｏｎａｍｉａ ｓｐ．）ＳＳＵ ｒＤＮＡ和派琴虫（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ ｓｐ．）ＩＴＳ ｒＤＮＡ 的保守区序列，设 摘要： 计特异性引物和Ｔａｑｍａｎ ＭＧＢ探针，建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光ＰＣＲ方 法．该方法可检测到包纳米虫基因的４４６拷贝质粒，以及派琴虫基因的１７１ 拷贝质粒，具有较高的 灵敏度．以１０倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板，测得该方 法的定量标准曲线相关系数分别为０９９９和１０００，显示出很好的扩增效率．同时该方法与尼氏单 孢子虫（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｎｅｌｓｏｎｉ）、沿岸单孢子虫（Ｈ．ｃｏｓｔａｌｅ）等其他贝类原虫，以及副溶血性弧菌 （Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、迟缓爱德华氏菌（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）和 爱德华氏菌（Ｅ．ｉｃｔａｌｕｒｉ）等海水 养殖常见致病菌之间无交叉反应，表现出较高的特异性．福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采 集的２９６份贝类临床样本的检测证明，该方法是一种有效的快速检测鉴定上述２种贝类原虫的方 法，具有良好的灵敏度和特异性，可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查，以及贝类疫病检疫监 控等领域． 海洋生物学；包纳米虫；派琴虫；ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ探针；双重实时荧光ＰＣＲ 关键词： ＤＯＩ：１０３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．２０９５４９７２２０１４０２０１８ 中图分类号：Ｐ７３５ 文献标识码：Ｂ 文章编号：２０９５４９７２（２０１４）０２０２８４０６ 　　包纳米虫（Ｂｏｎａｍｉａ ｓｐ．）和派琴虫（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ 简便的特点，广泛应用于临床检测中．实时荧光 ［１］ ｓｐ．）是导致海洋养殖贝类大量死亡的重要病原 ． ＰＣＲ技术避免了扩增产物的污染，具有比普通ＰＣＲ 至今国内外已发现的贝类包纳米虫有５ 种，其中列 技术更高的灵敏度和特异性，其中ＴａｑＭａｎ 探针实 入世界动物卫生组织（ＯＩＥ）水生动物疫病名录的包 时荧光ＰＣＲ技术通过使用不同荧光基团进行探针 纳米虫有牡蛎包纳米虫（Ｂ．ｏｓｔｒｅａｅ）和Ｂ．ｅｘｉｔｉｏｓａ，派 修饰，能够实现多通道分析，从而达到一次ＰＣＲ实 琴虫有海水派琴虫（Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓ）和奥尔森派琴虫 验检测多种病原体，或多个基因的目的．根据其３’ ［２］ 端标记的荧光淬灭基团的不同，ＴａｑＭａｎ探针可分为 （Ｐ．ｏｌｓｅｎｉ） ．包纳米虫病和派琴虫病在我国东南 沿海均有流行，严重危害贝类养殖业发展，其中主要 ２种，普通ＴａｑＭａｎ探针和ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ探针．普通 ［３４］ ＴａｑＭａｎ探针３’端标记有荧光淬灭基团，而ＴａｑＭａｎ 种类病原为牡蛎包纳米虫和奥尔森派琴虫 ．包 纳米虫病和派琴虫病流行季节相同，临床症状相似， ＭＧＢ探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，因其本 如果能建立同时检测这２ 种疫病病原的方法，则能 身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度．同时 提高病原检测效率，给疫病的快速诊断、监控和预警