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第二章 细胞生物学研究方法 第二节 生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的，没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 （一）、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1. 物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）、显示方法 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。 三、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。 四、放射自显影术 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。 由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记。14C和3H均为弱放射性同位素，半衰期长，14C为5730年，3H为12.5年。一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR）来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用3H甘露糖、3H岩藻糖等。 五、分子杂交技术 分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究DNA