大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征_临床医学论文.docVIP

大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征_临床医学论文 大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征_临床医学论文 【摘要】 目的 研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。方法 利用脂质体介导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体，转染HEK293细胞进行扩增，用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测HCN4 mRNA表达，采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上HCN4电流。结果 大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞，记录到一系列超极化内向离子流，该电流呈电压、时间依赖性，没有明显的失活，在-150 mV时电流幅值为(540±24.1)pA，电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12)，半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV，HCN4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV。结论 应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达。 【关键词】 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道；异源性表达；膜片钳；大鼠 　　Abstract: Objective To explore the current characteristics and expression of HCN4 myocytes in rat ventricular myocytes into HEK293. Methods The HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pTracer-CMV-GFP to form the transfer vector.The mRNA expression was detected by reverse transcriptase-PCR method after being transfected into the HEK293 cell using Lipofactamine2000 reagent for amplification，then to use whole cell patch clamp recording the current.Results An inward current was recorded in response to hyperpolarization activaton in transfected HEK293 cell The mHCN4 channel began to activate in voltage and time dependent manner without deactivation threshold voltage and potential of half-maximal activation（V1/2）was -70mV,（-105.7±12.0）mV ,respectively. Conclusion HCN4 gene is successfly heterologously expressed by the method of Lipofactamine transfected. 　　Key words: hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel；heterologously expressed；patch clamp recordings；rat 心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自动除极最主要电流之一，起搏电流(pace maker current，If)无论在自律细胞的起搏［1］，还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆［2-3］，分别是HCN1～HCN4，超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础，起博电流表现为广泛的区域电压依赖性，心脏主要表达HCN2和HCN4［4］，在窦房结的HCN含量最高，HCN4是绝对优势的亚型，占总HCN mRNA的80%以上。HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5)DNA的永生化细胞，贴壁生长，能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。本实验应用含目的基因HCN4和携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染［5］，通过瞬时表达进行检测，结合膜片钳技术记录转染细胞后的mHCN4通道电流的特征。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒和主要试剂 　　携带