大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达_临床医学论文.docVIP

大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达_临床医学论文 大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达_临床医学论文 作者：董智勇 李忱 陈东 孟晓婷 李玉林 【摘要】 目的 建立胚胎不同时期羊膜上皮细胞（AECs）表达脑源性神经营养因子（BDNF）与神经营养素（NT）mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT的最佳时期。方法 采用实时荧光定量PCR检测胚胎不同时期（11，13，17，21 d）AECs中BDNF与NT的表达差异。结果 绘制出大鼠AECs中BDNF、NT的基因表达差异时程图：BDNF的表达随着胚胎发育持续上调，至17 d达到最高，然后其表达开始下调；NT的表达在13 d达到最高，然后开始下调。结论 初步确定13～17 d是大鼠AECs分泌BDNF、NT的最佳时期。 【关键词】 羊膜上皮细胞；脑源性神经营养因子；神经营养素；实时荧光定量PCR 　　【Abstract】 Objective To investigate the differences of BDNF and NTancy rats and establish the phase diagram of gene expression to find the best time of BDNF and NT3 secretion. Methods The differences of BDNF and NT3 gene expression of the amnion epithelial cells (AECs) from different phase of pregnancy rats (E11, 13, 17 and 21 days) were detected by real time PCR. Results BDNF mRNA was upregulated and lasted with embryonic development, reached the peak on E17 d, and then was downregulated. NT3 mRNA reached the peak on E13 d, and then was downregulated.Conclusions The best time of BDNF and NT3 secretion of AECs are from E13 d to E17 d. 　　【Key words】 Amniotic epithelial cells; Brain derived neurotrophic factor; Neurotrophin 　　羊膜上皮细胞（AECs）是羊膜的主要细胞成分，实验证明人AECs（HAECs）可合成释放神经营养素3（NT）与脑源性神经营养因子（BDNF）等多种营养因子〔1〕，移植到帕金森（PD）鼠纹状体的HAECs能够存活并分泌BDNF、NT，使PD模型鼠的行为学症状在细胞移植后2个月内得到改善〔2〕。同时本课题组应用实时荧光定量PCR（RT）、Western印迹证明大鼠AECs（RAECs）中也有BDNF、NT、蛋白质的表达；RAECs（E15）的条件培养基可以促进神经干细胞（NSCs）的存活与神经分化〔3〕。因此，RAECs可以作为细胞模型代替HAECs研究AECs在胚胎发育过程中的作用。本研究应用RT建立胚胎不同时期AECs表达BDNF、NT的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT的最佳时期，为AECs应用于临床奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 Trizol试剂购自北京博奥生物公司；引物合成由北京博奥生物公司完成；RT仪（Roche公司Light Cycle PTC）； Lightcycler（购自Roche公司）；孕期11～21 d Wistar大鼠，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。 　　1.2 总RNA提取 取胚胎不同时期（11、13、17、21 d）新鲜羊膜上皮组织，应用Trizol法提取组织总RNA。取100 μg羊膜上皮组织于冰上剪成1 mm3小块，加入1 ml Trizol液，反复吹打，离心；用吸管取上清放入1.5 ml离心管中，室温放置10 min；加入200 ml氯仿混匀，室温放置3 min，4 ℃离心15 min(12 000 r/min)；吸上清至另一离心管中，加异丙醇500 ml，室温放置10 min。离心沉淀，弃上清，沉淀用70%的冷乙醇洗1次，倒置管，自然干燥；每管加20 μl 1‰DEPC水溶解RNA，取10 μl RNA作逆转录，其余-70 ℃冻存备用。 　　1.3 RNA质量鉴定 用紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，A260与A280比值在1.8～2.0之间，