大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定_临床医学论文.docVIP

大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定_临床医学论文 大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定_临床医学论文 作者：任吴超，李冬民，王 璇，高 玉，韩 燕， 宁启兰，张富军，宋天保，吕社民 【摘要】 目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx基因表达系。方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉，经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞；免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达；构建pEGFP表达载体并酶切鉴定，用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后，荧光显微镜观察GFP表达，免疫组织化学鉴定Pdx的表达。结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性；pEGFP表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx蛋白。结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx表达系。 【关键词】 大鼠；肝脏干细胞；胰腺十二指肠同源盒；表达载体 ABSTRACT: Objective To establish a liver stem cell line expressing pancreatic duodenal homeobox (Pdx in rats. Methods Rat liver stem cells were obtained by digestion of collagenase IV and isolation after hepatic portal vein puncture. The liver stem cells were identified by using specific antibodies against cytokeratin 18 and 19 and AFP. The stem cells were transfected with pEGFPPdx1 expressing vector using liposome 2000, and Pdx1 exprssion was identified by observing green fluorescence protein expression under the microscope and by using immunohistological staining. Results Rat liver stem cells isolated and cultured through hepatic portal vein puncture were capable of mitosis and proliferation, and could also express cytokeratin 18 and 19 and AFP, suggesting that they are indeed liver stem cells. Pdx1 gene transfected cells can express green fluorescent protein reporter gene and Pdx1 protein. Conclusion A Pdx1 expressed rat liver stem cell line has been successfully established. KEY WORDS: rat; liver stem cell; pancreatic duodenal homeobox (Pdx1); expression vector 　1型糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病。建立内源性胰岛分泌系统,包括胰腺移植、胰岛移植等对于1型糖尿患者来说是重要的治疗手段。但是，伦理和免疫排异反应使其应用受到限制。近年来，人工诱导干细胞向能够分泌胰岛素的细胞进行分化，为胰岛移植提供了全新的细胞来源[1]。肝脏和胰腺来自胚胎内胚层的同一个细胞群，进化上具有相似性。肝脏干细胞可能具有在一定条件下转化为具有胰岛特征的胰岛素分泌细胞的能力[2]。 胰十二指肠同源盒(pancreatic duodenal homeobox, Pdx蛋白是胰岛内分泌细胞群发育、分化与成熟的主要调控蛋白[3]。小鼠体内的Pdx基因的沉默和敲除可致胰腺发生缺失[4。 已经有研究证明Pdx在成体干细胞中的异位表达可实现成体干细胞向胰腺细胞的分化。但是，对于肝脏干细胞的研究尚无详实报道。我们成功从大鼠乳鼠肝脏中分离出肝脏干细胞，并且用从胰腺中分离出的Pdx基因成功转染这种细胞，为研究肝脏干细胞向胰岛样细胞的体外定向分化奠定了实验基础。 1 材料与方法 1.1 实验动物 出生后1～3d的SD大鼠新生乳鼠，由西安交通大学医学院