大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白2的表达变化_临床医学论文.docVIP

大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白的表达变化_临床医学论文 大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白的表达变化_临床医学论文 【摘要】 目的: 研究大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）后水通道蛋白（AQP）的表达变化与肾功能变化的关系。方法: 建立大鼠左侧肾脏缺血再灌注损伤模型, 于IRI不同的时间点处死大鼠, 留取尿液、 血清、 肾脏标本行尿常规、 肾功能、 肾脏病理形态学及AQP的免疫组化、 RT检测。结果: 大鼠肾脏IRI后出现尿量增多、 尿渗透压降低, 血肌苷、 尿素氮升高症状; HE染色示肾小管上皮细胞肿胀、 坏死、 脱落; AQP表达量及其mRNA含量均较对照组减少, 这些变化于IRI 3 d时最低, 至IRI 7 d时恢复正常。结论: 肾脏IRI后AQP表达的减少可能是急性肾衰竭时尿量增多、 尿渗透压降低的重要因素之一。 【关键词】 肾缺血再灌注损伤 急性肾衰竭 水通道蛋白 　　缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）, 是指发生缺血的组织器官, 当恢复血液灌注后缺血性损伤进一步加重的现象。肾脏作为高灌注器官, 非常容易发生IRI, 临床上因为IRI而导致的急性肾功能衰竭（acute renal failure, ARF）的现象非常多见, 如: 严重的烧伤、 大出血、 感染性休克等均会导致急性肾脏缺血, 当肾脏恢复血液灌注后都会因加重肾脏的缺血损伤而引起ARF［1］。而在肾移植中IRI是造成移植肾原发失功、 移植失败及慢性排斥反应的主要原因之一［2］。因此, 肾IRI时的病理生理变化一直是许多学者研究的重点。水通道蛋白（aquaporins, AQP）是20世纪90年代新发现的一组细胞膜转运蛋白, 普遍存在于动、 植物及微生物中, 自从它被发现以来, 国内外学者对它们进行了大量的研究［3, 4］。目前在哺乳动物已鉴定出 13种水通道蛋白［5］, 其中分布于肾脏的有AQP1、 AQP2、 AQP3、 AQP4、 AQP6、 AQP7、 AQP8［6, 7］。已证明AQP在机体许多生理病理过程起着重要的作用, 但在肾IRI过程中的变化尚不清楚。为此, 我们通过将大鼠右侧肾脏摘除, 左侧肾蒂夹闭40 min后恢复血液灌注, 建立由IRI导致的ARF模型, 观察 AQP在肾脏的表达变化及与ARF发展的关系, 以期从新的角度探讨ARF的发病机制, 并为疾病的防治提供理论基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 健康成年雌性Wister大鼠 (质量250±30 g), 80只, 由大连医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分为10组: 对照和缺血再灌注1、 2、 3、 5、 7 d组; 每组8只。AQP一抗体为兔抗鼠抗体购自武汉博士德公司; 免疫组化用SP试剂盒购自北京中杉金桥公司; AQP及β引物由大连医科大学生化教研室马郁芳教授惠赠; 琼脂糖电泳DNA 回收试剂盒、 DRR019A mRT试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肾缺血再灌注损伤模型的建立 所有实验动物均术前12 h禁食, 自由进水。 　　1.2.2 麻醉方法 实验大鼠应用100 mL/L 水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射麻醉。 　　1.2.3 实验组和对照组 参照Kwon等［8］的方法建立肾缺血再灌注损伤模型。具体方法如下: 大鼠麻醉成功后腹部备皮, 取仰卧位, 应用5 mL/L碘伏溶液常规消毒铺无菌孔巾, 取腹部正中切口, 进入腹腔后小心分离并结扎右侧肾蒂后摘除右肾; 游离左侧肾蒂, 用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂, 阻断出入肾脏血流（在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水）, 40 min后重新恢复肾脏血液灌注。当松开动脉夹后肾脏在2～5 min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血再灌注损伤模型建立成功, 肾血管无血栓形成, 关腹。若超过5 min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成, 排除出实验组。对照组摘除右肾后, 仅游离左侧肾蒂而不进行夹闭, 40 min后关腹。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。 　　1.2.4 标本采集 分别于再灌注1、 2、 3、 5、 7 d后处死大鼠, 留取标本。留取实验大鼠处死前24 h尿液标本, 计录尿量及进行尿渗透压检测。经腹主动脉取血6～8 mL静置30 min后1 000 r/min, 离心10 min, 留取血清以行血肌酐及尿素氮检测。取血后迅速摘除大鼠左侧肾脏, 予以用PBS液漂洗冲去血液后分别沿肾脏 冠状面和矢状面将肾脏切为4份, 一份予以用100 mL/L的甲醛PBS液固定以行病理学及免疫组织化学检测, 余下3份于液氮冷冻1 h后转入-80℃冰箱保存以行RT检测。每只大鼠相应检测标本取材部位保持一