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大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施_临床医学论文 大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施_临床医学论文 作者：何俊，徐文莉，曾思，曾因明，庞庆丰 【摘要】 目的 改良原代肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AM)培养技术，提高AM培养效果。方法 SD大鼠，在体支气管灌洗肺获取AM，通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化，台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率，瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果 AM体外培养后40 min即见细胞贴壁;2～3天时，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富。台盼蓝拒染实验示AM存活率≥95%，瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论 本实验改良了原代AM培养的技术方法，提高了原代AM培养效果。 【关键词】 肺泡巨噬细胞;细胞培养;技术改良 　　Abstract: Objective To modify the techniques for primary culture of highly purified the primary rat alveolar macrophages (AMs). Methods AMs were isolated in vivo and cultured with such modified techniques as pre-injection of air and reclamation of brochoalveolar lavage fluid with 14- bugle syringe needle, low-speed centrifugation and multi-blowing before plating on 6-well culture plates. The morphological changes were observed under the inverted microscope. The cell survival rate was detected with trypan blue dye exclusion test, and cell purity was determined by Wright-Giemsa staining. Results In vitro, AMs adhered to plastic surface within 40 min; 2-3 days later, cell morphology presented mixed shapes, i.e., circular, irregular and spindle shapes. The trypan blue test showed a survival rate ≥95% of the AMs and Wright-Giemsa staining indicated a purity ≥95% of the AMs. Conclusion The modified techniques employed in our experiment had better results for the isolation and primary culture of AMs. 　　Key words: alveolar macrophage; cell culture; technique modification 　　肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)分布于呼吸道-肺泡表面，是肺部抗感染的第一道防线, 是肺部抵抗病原感染的重要组成部分。AM不仅具有吞噬和抗原递呈功能，而且还能分泌多种生物活性物质,对急性肺损伤的发生、发展及转归具有重要影响[1-3]，因此，AM一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。但由于在分离培养原代AM过程中存在获取率低、混杂红细胞、容易污染损伤、不易贴壁等技术难题[4]，目前国内外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S[5]、大鼠肺泡巨噬细胞株 NR8383[6]等细胞株替代原代AM，然而AM细胞株与原代培养的AM在细胞形态、细胞活力及细胞生理等方面存在明显差异。因此，优化原代AM培养技术从而得到理想的AM对研究肺部感染性疾病发生机制有很重要的作用。本研究探讨AM培养技术的改良措施及注意事项。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。 　　1.1.2 主要试剂和器材 DMEM(低糖)培养基( Gibco公司 )，胎牛血清(杭州四季青有限公司 )，青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司