从大容量抗体库中筛选抗TNFα人单链抗体_临床医学论文.docVIP

从大容量抗体库中筛选抗TNF人单链抗体_临床医学论文 从大容量抗体库中筛选抗TNF人单链抗体_临床医学论文 作者：王欲晓, 乔媛媛, 周丽君, 王琰 【摘要】 目的: 从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNF的人单链抗体（scFv）。方法: 以TNF为抗原, 通过 “吸附洗脱扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体, 对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定 。结果: 经过4轮筛选, 获得62个与TNF结合的阳性克隆, 其中27个特异性结合的克隆, 指纹分析有7种不同的可变区片段; 其中5种获得可溶性表达; 基因序列分析表明其轻重链分属VλⅠ和VHⅣ亚群。结论: 利用单链大容量抗体库技术可以不经免疫制备获得特异性抗TNF的scFv, 为今后的研究和应用提供依据。 【关键词】 大容量噬菌体抗体库; TNF噬菌体抗体 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α, TNF）是炎症反应的主要介质, 研究发现TNF水平的升高与多种病理过程有关。如类风湿性关节炎(RA)、 感染及创伤引起的休克、 炎症性肠病(Crohn’s)及移植物抗宿主病等。抗TNF单克隆抗体(mAb)对这些病理过程可以起拮抗作用, 从而可能对许多疾病有治疗作用［1］。目前国外已将抗TNF抗体作为治疗RA、 Crohn’s等的药物正式进入临床并显示出良好的应用前景。由于鼠源mAb具有异源性, 限制了其在人体内的应用, 人抗体的制备难度很大。抗体库技术的出现为人抗体的制备提供了有效手段。我们实验室构建了大容量噬菌体抗体库, 并从中筛选出多种针对不同抗原的特异性抗体［2］。本实验拟从大容量噬菌体抗体库中筛选出抗TNF的人单链抗体(scFv), 为今后的研究和应用提供依据。 1 材料和方法 1．1 材料 大肠杆菌菌株XL1ue、 Bs1365、 无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151和VCSM13为本室保存; 大容量噬菌体抗体库为本室构建, 详细过程见文献［2］; 重组人TNF抗原由我实验室表达和纯化; 限制性内切酶为TaKaRa公司产品; 卵清蛋白（OA）和铁蛋白（Fer）购自Sigma公司、 各种酶标抗体购自Promega公司和Sigma公司; 抗原管（Immuno）购自丹麦NUNC公司。 1.2 方法 1.2.1 大容量噬菌体抗体库工作库的制备 原始噬菌体抗体库以100∶1的比例（multiplicity of infection, MOI=100）超感染BS1365细胞, 37℃水浴保温1 h, 使多副本载体进入同一个细胞［2, 3］, 加2YT至400 mL, 补足Amp 100 mg/L振荡培养至OD=0.5左右加5 mL辅助病毒VCSM13(pfu=1.7×1012), 30℃培养过夜, 次日收集噬菌体抗体库, 测定滴度。再以MOI≤1的比例感染1000 mL对数生长期的XL1菌, 37℃静止30 min, 取少许铺含Amp的培养盘计算库容, 补足Amp, 加入10 mL VCSM13, 30℃过夜, 次日回收上清, 常规PEG沉淀, 获得工作库。 1.2.2 抗TNF抗体的筛选 将TNF用0.05 mol/L碳酸盐Buffer稀释至100 mg/L, 以1 mL包被免疫管, 4℃过夜, 次日用30 g/L脱脂奶粉封闭2 h, 加入1 mL噬菌体抗体库（约1×1013个CFU）, 37℃孵育2 h, 以含0.5 mL/L Tween20的PBS洗15次, （第1轮洗15次, 以后洗涤20次以上）, 用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体, 先加入1 mL新鲜XL1菌直接感染, 37℃孵育15 min, 转入 10 mL SB培养液中; 再将细菌感染回收后的免疫管中加入1 mL洗脱液（0.1 mL HCl, 以甘氨酸调至pH至2.2）37℃静置15 min再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后, 加入45 μL 2 mol/L Tris中和, 再加入2 mL XL1细胞37℃静置15 min, 加入7 mL的SB培养液。从2次回收的菌液分别取出适量铺氨苄青霉素培养盘测定滴度（CFU）, 其余菌液37℃培养3 h, 扩大体积到100 mL, 加入1.7×1012pfu辅助病毒VCSM13, 30℃振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度, 并计算噬菌体抗体的投入产出比（回收率）, 作为特异性噬菌体抗体富集的指标。次日回收上清, 常规PEG沉淀, 所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选［4, 5］。 1.2.3 噬菌体抗体的筛选 从筛选第三、 第四的培养盘随机挑取集落在含有Amp的2YT培养液中过夜, 第2天取30 μL细菌到1 mL SB培养液中, 37℃培养至对数生长期, 加入辅助病毒VCSM13, 30℃培养过夜, 收取上清即