灵芝(Ganoderma+lucidum)鲨烯合酶基因克隆、表达特性与其保守性的研究.pdfVIP

China Societyof Mycological Medicinal on Chinas Industry theFirst of Fungi Proceedingsof SymposiumDevelopment lucidum)鲨烯合酶 灵芝(Ganoderma 基因克隆、表这特性及其保守牲的研究 CLONING0FTHE SYNTHASEGENEFROM SQUALENE ISOFGENEEXPRESSION GanodermalucidumANDANALYS ANDCONSERVATION 赵明文 南京农业大学生命科学学院 灵芝(Ganoderma 合物是灵芝的重要药用成分，具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝等功能。因此三萜 含量的多少成为衡量灵芝质量高低的重要指标。作为次生代谢产物，三萜类化合物是通过甲羟戊 酸途径，由法呢酯焦磷酸产生鲨烯、再转化成2，3一氧化鲨烯，最后经过一系列的氧化、还原和 环化反应形成的。鲨烯合酶是三萜化合物合成的关键酶，可催化2分子的法呢酯焦磷酸缩合产生 鲨烯。鲨烯合酶的含量与活性高低决定了三萜化合物产生量的多少。 根据十九种不同来源的灵芝菌株的生长速度，从中选出了菌丝体阶段生长性能良好的10个菌 株进行液体培养，并测定了菌丝中三萜和多糖的含量。结果表明：不同灵芝菌株在三萜和多糖含 量上存在着一定的差异，其中多糖含量以汉城2号、日本灵芝、南韩灵芝为高；三萜含量却以韩 体不同发育时期和孢子粉中多糖和三萜含量的变化，结果显示在孢子粉中多糖和三萜含量较子实 体中的含量高。 根据灵芝鲨烯合酶Western 文库。 根据对已发表的其它物种鲨烯合酶氨基酸序列，针对鲨烯合酶的保守区，设计简并引物，以 利用获得的灵芝鲨烯合酶基因特异片段，设计一对专一引物，结合cDNA文库两臂的通用引物，分 467个氨基酸残基。 将获得的灵芝鲨烯合酶基因的全长cDNA序列，以NdeI和BamH I位点装入原核表达载体 后表达出了分子量约为48KD大小的蛋白。 灵芝鲨烯合酶的氨基酸序列和核苷酸序列分析结果表明，灵芝鲨烯合酶与玉米黑粉菌鲨烯合 酶的同源性较高。 233 中国葡物学会 首届菇用真菌产业发展受学术研讨会论文巢 根据基因的5’和3’端DNA序列设计引物，扩增灵芝的基因组DNA，得到灵芝鲨烯合酶基因 的全长基因组序列，该序列全长为1984bp，基因由4个外显子和3个内含子构成，它们的长度分 845中，获得重组质粒 348bp(exon4)。将灵芝鲨烯合酶基因组序列克隆到酵母表达载体pYFl pYFl845+SQS，将重组质粒转化到鲨烯合酶缺陷型酵母2C1中，可以实现功能互补。 对灵芝鲨烯合酶基因结构和其它物种鲨烯合酶基因结构的分析表明：鲨烯合酶基因结构保守 性较差。 Southern Blotting分析结果表明，在灵芝基因组中灵芝鲨烯合酶基因为单拷贝。 利用针对鲨烯合酶第四保守区的多克隆抗体，检测了不同发育阶段灵芝