狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬-2型腺病毒构建与免疫研究.pdfVIP

——一生亘茎望堡墨堑些丝塑塑!!些墨篓塑 ． 狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬一2型腺病毒构建及免疫研究 王永志1，扈荣良“，王莘‘，张守峰，李海涛，肖跃强，夏成柱 30062) (军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春l 此表达盒．在此表达盒中启动子是cw，终止信号是SV40 polyA；将此表达盒放入含CAV一2 E3区的载体中， 细胞，包装出表达盒正、反向插入E3区的重组犬一2型腺病毒：将两株熏组腺病毒免疫幼犬，在幼犬体内 产生了针对狂犬病病毒的抗体。 关键词：狂犬病；糖蛋白；膜外区；重组犬一2型腺病毒 动，狂犬病控制工作大见成效，但20世纪90年代以后期疫情又开始上升并日趋严重。据卫生部公布的数 具有重要的实际意义。狂犬病病毒(Rabies 膜外区、跨膜区和膜内区三个，其中膜外区含有病毒的主要中和性抗原表位。 活载体疫苗以其成本低、效果好、使用方便等诸多优点，得到较快发展。犬一2型腺病毒(Canine 毒有四个早期转录区，其中E3区是病毒复制的非必需区，缺失或插入外源基因不会影响病毒的复制。因 隆进狂犬病病毒糖蛋白的膜外区基因，以期获得含有糖蛋白膜外区的重组犬一2型腺病毒，为新型狂犬病 重组疫苗的应用奠定基础。 1材料与方法 1．1菌种、毒种、细胞与试剂本实验所使用的菌种DH5 1．2细菌的培养及质粒酶切连接转化本实验所有的细菌培养及质粒酶切连接转化都是参照第三版分子克 隆实验指南进行…。 TCGGCCGTTACAAGTCAACTCCTGAGACCTG(EagI) 小时。以此产物为膜板用Vent。DNA 418 人畜共患传染炳防治=『!}}究新成果=}L编 1imited生产的试剂盒回收DNA。 DNA 由于Ventw 中，挑选阳性重组子(pGzT)，测序。 DNA 用NheIBaⅢfII酶切，补平脱磷后回收大片段。两片段用T4 希氏大肠杆菌DH5a，挑选鉴定阳性重组子(pEGFP—Gz)。 I．5 挑选阳性重组子pCAV一2G2F和pCAV一2G2R。 u MEM中。取25ullipofectamine 70％7．醇沉淀后溶于4d水中，取5gDNA溶于300ul ul MEM，然后转移至50ml80％汇合的MDCK细 溶于300 MEM中，混合两者，室温放置20min后加入1．4ml MEM完全培养基，在5％C0：、37℃饱和湿度下培养，每日观察。 ul新鲜配制的细胞裂解液(0．6％ i．8病毒基因组的提取及酶切鉴定病变细胞用PBS洗2次，加入800 u1 5M u Proteinase NaCI，冰上放置I小时， SDS。lOmmolEDTA，100g／ml K)，37C放置1小时后加入200 10ug／ml的Rnase 胶电泳鉴定。 1．9动物试验将表达盒正向插入和反向插入腺病毒基因组的两株病毒，以病变细胞混合物的形式免疫一 月龄的幼犬，接种量为0．5ml／条，通过ELISA检测免疫效果。 2 结果 2．1 RV糖蛋白膜外区的克隆及测序琼脂糖凝胶电泳显示RT—PCR产物与设计大小相符，酶切鉴定T载体 产物pG：T正确，测序结果表明，得到的基因序列与GenBank中的狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列相同。 2．2表达盒