HPLC法测定真菌多糖平均分子量方法地研究.pdfVIP

鬻韪}艿票丸讧省学术卑会论文亲 HPLC法测定真菌多糖平均分子量方法的研究 孔祥辉①张介弛⑦张丕奇@韩增华④马庆芳⑤戴肖东⑥ 摘要：建立一个测量多糖分子量的简便方法。方法采用热水浸提法提取黑木耳多糖，经超过滤， o建立了用HPLC法 去蛋白，DE_AJE一52和SephacrylS-400分子筛柱层析纯化得到精多糖(Am,1 测量多糖分子量的方法。结果用HPLC法测定多糖分子量的线性方程为Y=-0．4657X+10．9686， 一多糖)用此法测定平均分子量为55．9万Da。结论HPLC法测定真菌多糖分子量准确、快 速。 关键词：HPLC法，真菌多糖平均分子量，黑木耳多糖；纯化； 真菌多糖分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作。多糖分子量的测定方 法有渗透压法、粘度法、光散射法、超离心法、凝胶过滤法等，上述各法均十分繁琐，误差 较大[21。而HPLC法(高压液相色谱法)用于真菌多糖分子量测定具有灵敏度高、快速、简 便易行、结果准确等优点翻。本文主要建立了用HPLC法测定真菌多糖平均分子量的方 法。 黑木耳(Auriculariaauricula)营养丰富并具有药效价值，其中主要活性成分黑木耳多 糖具有调节免疫力和抗肿瘤作用111。笔者从黑木耳中分离纯化得到高纯度的黑木耳多糖 组分，并用此法测定了所纯化黑木耳多糖的平均分子量，为真菌多糖分子量的测定提供 —个简便、准确、快速的方法。 一、材料与方法 (一)材料 黑木耳子实体黑龙江省微生物研究所食用菌基地人工栽培生产。 (二)仪器与试剂 DEAE一52、Sephacryl SUGAR (Pharmacia)；双蒸水：HPLC级，用0．45斗nl微孔滤膜过滤。 (三)方法 1．高压液相色谱法测多糖分子量标准曲线的建立 SUGAR 量1 KS一804。保 01，流速0．6ml／min，RID-6A示差折光检测器检测，色谱柱Shodex 留时间与分子量对数作图，画出标准曲线，计算相关系数r。 2．多糖分离纯化方法及纯度分析 (1)多糖分离取100 g黑木耳，浸洗，用匀浆机打碎，加50倍水90。C水浴提取4h， 提取液离心，沉渣加2000rnl蒸馏水于90。C水浴二次提取4h，共提取3次，合并上清液。 浓缩，Sevag法瞰去蛋白。所得溶液加入3倍95％的乙醇沉淀，真空干燥得去蛋白多糖AAP。 田 HElLoNGJIANGsHENG×uESH 集，透析，浓缩，醇沉，沉淀依次以无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤，真空干燥得主峰多糖组分 AAPl。 (2)薄板层析硅胶板活化，点样量10斗l(多糖浓度2mg／m1)。展开剂：乙酸乙脂：醋 酸：水为4：l：l；显色剂：苯胺一二苯胺。’ 2h；染色液0．1％甲苯胺蓝；脱色液为乙醇：水：醋酸=5：5：0．1。 OD值 液洗脱，分部收集，用硫酸蒽酮法咧各管糖含量，以洗脱体积数为横坐标，620nm 为纵坐标画出洗脱峰。 3．高压液相色谱法测黑木耳多糖平均分子量 将所纯化黑木耳多糖组分用双蒸水配成0．2％浓度，色谱柱用流动相冲洗干净，上样 程计算分子量。 二、绪果 (一)HPLC法测多糖分子量标准曲线建立 高压液相色谱法测得各标准品的保留时间(见表1)。保留时间与分子量对数作曲线 X104与 (见图1)，回归方程为Y一0．4657X+10．9686，计算芦0．994