NTG诱变选育埃博霉素高产菌株地研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次奎目发酵工程学术讨论套静主采 NTG诱变选育埃博霉素高产菌株的研究 陆一呜， 罗立新， 潘力 (华南理工大学生物科学与工程学院，广州510640) 摘要：纤罐堆囊菌产生的次缎代谢产物埃博霉翥是受医学界广泛关注的抗癌良药，由于 其较低的产量阻碍了其工业化的发晨，本文采用纤维堆囊苗DSMll999作为出发菌株．通过 NTG化学诱变的方法来缔选优慧菌种．最终得到两株埃博霉素的产量大大提高的优是 菌株． 关键诃：纤维堆囊苗；NTG；育种 氏阴性细菌，能够产生丰富的生物活性次级代谢产物。而且产物生物活性作用的多样性 可以与著名的链霉菌类群相比拟“]。 cellulosum)属于粘细菌的溶纤维素类群，它产生的大环类 纤维堆囊菌(Soranglum 的抗癌物质。埃博霉素能与真核细胞中的微管骨架结合，导致染色体分离受阻．细胞核 不能分裂，作用的有效浓度为10～20ng／ml。埃博霉素的作用机制与著名的抗癌药物紫 杉醇相同，但是其来源简单不受限制，毒性更小o]。虽然目前有很多种化学法可以合成 埃博霉素，但是具有反应条件苛刻，成本高，合成路线长以及产率低等缺点啪，而且会对 环境造成污染，不是绿色的化学反应，而工业发酵制备合成埃博霉素则可以克服上述缺 点[．】。本文作者采用亚硝基胍(NTG)作为诱变剂，研究不同诱变条件下的诱变效应，筛 选出丁埃博霉素产量较高的几株突变株。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株：纤维堆囊菌(Sorangium Colhe— tionof andCell Microorganisms 1．1．2种子培养基(G52培养基)：干酵母粉2g／L，MgSO,-7H20lg／L，caCk·2H20 lg／L，脱脂奶粉zg／L，马铃薯淀粉89／L，无水葡萄糖2 调pH至7．4，0．1MPa灭菌20rain。 1．1．3pH 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(031357) *通讯作者：罗立新，男。1966年生，副教授，博士。华南理工大学生物科学与工程学院一主要从事微生 cn 物制药和生物化工方面的研究工作，Td edu 陆一鸣等：NTG诱变选育埃博霉素高产菌株的研究 1．1．4发酵培养基(1812培养基)：马铃薯淀粉20g／L，脱脂奶粉llg／L，EDTA铁钠 8mg／L。用KOH调pH至7．8，0．1MPa灭菌20mins。 1．1．5 0．5 VY／2固体培养基：千酵母粉5g／L，Catl2·2H。Olg／L，Vmmg／L，Agar 15g／L，用KOH调节pH至7．2。 1．1．6IBl2液体发酵培养基：马铃薯淀粉20g／L、脱脂奶粉11g／L、EDTA—Fe—Na8 mg／L用KOH调pH至7．8 1．1．7MB平板：酵母粉1％，蛋白胨3％，葡萄糖3％，琼脂粉1．5％，灭菌后加人美蓝无 菌水溶液，使其终浓度为lmg／30m|。 1．2方法 6．0的 1．2．1菌种的诱变：取培养了40～42h的G52培养物5ml，离心收集菌体，用pH 磷酸缓冲液洗涤两次，然后重悬于5ml，pH6．0的磷酸缓冲液中，制成菌悬液。取NTG 母液，加入菌悬液中，配制成各浓度的含NTG的菌悬液，在不同温度下进行诱变处理 30min。将菌悬液4℃离心，用冷的无菌水洗涤三次以终止诱变[“。加入相同体积的G52 理盐水进行适当的十倍稀释，涂于VY／2平板，30℃，培养2～3d。 1．2．2正突变优势菌株的初筛：无菌操作取直径为1～2mm的单菌落接种于G52液体 培养基，30℃、180r／min振荡培养3 d后，接入1