非小细胞肺癌表皮生长因子受体双向基因测序的研究.pdfVIP

第四届全国肿瘤病理学诊断研讨套论文汇编 ·193· ·呼吸系病理· 非小细胞肺癌表皮生长因子受体双向基因测序研究 赖仁胜谢玲中龙树朱长乐钱军 (南京中医药大学附属医院病理科／国家中管局分子生物学三级实验室，南京210029) PCR扩增EGFR 的非小细胞肺癌组织标本通过模板DNA提取、定量和Touchdown eXOHl8、19和21序列，进行正、负链基因测 序分析，并与10例非小细胞肺癌患者血液标本对照。结果32例非小细胞肺癌组织发现7例共9种突变，即已报道的5个 腺癌的突变率类似，但存在中国人自身新的突变位点(L833V和H835L)及内含子改变，该突变率与国内易瑞沙治疗非小细胞 肺癌有效率基本吻合。 关键词：表皮生长因子受体；测序；突变；易瑞沙 实体肿瘤表皮生长因子受体家族的受体酪氨酸激酶(EGFR—TK)调控癌细胞的增生、浸润、分化和转 移。分子靶向药物N一(3一氯一4一氟苯基)一7一甲氧基一6一(3一吗啉丙氧基)喹唑啉一4一胺(易瑞沙， 对本院临床病理活检和会诊的32例非小细胞肺癌组织EGFRl8、19和2l外显子进行双向测序研究。 1材料与方法 1．1分组 史，但均无易瑞沙治疗史。其中肺腺癌19例、腺鳞癌4例，鳞癌8例，肺大细胞癌1例。 1．1．2对照组lO例非小细胞肺癌患者血液标本，均由病理诊断证实。每例取静脉血2ml。 1．2 测序序列及观察点，并用Oligo软件设计PCR引物。 TIC 1．2．1 TACCAACTrCTGTC EGFR第18外显子片段长度为437bp，上游引物：5’TGT 3’，下游引 AACAAA AG 物：5’CAGTGA GAGTAA 3’。 l_2．2 TGTGATTCGTGGAGCCC EGFR第19外显子片断长度为411bp，上游引物：5’CAG 3’，下游引 ATGAGCAG3’。 物：5’TAGGATGTGGAG CAGCGGc1TACATCTTC 1．2．3 EGFR第21外显子片段长度为399bp，上游引物：5’CAG 3’，下游引 GCCTGGTCCCTG GTGTC 物：5’GCA 3’。 1．3基因测序方法 含量20．s／V,1纳入检测。 1．2．2 Buffer PCR扩增使用ABI一2700型测序级扩增仪，扩增目的基因片段。10×PCR2山．HotStarTaq DNA X 4 2 Polymerase(QIAGEN公司)0．2Q·Solutionwl，dNTPV-I，Primer各1wl，模板DNA1斗l，去离子 wl，5 min，72℃延伸1 s，57℃退火1 水8．8ILl。94℃变性50s．63℃一58E退火1 min，共循环lO次；94。C变眭50 min。 min，72℃延伸1rain，共循环30次，最后于72℃延伸10 ·194· 第四届全国肿瘤病理学诊断研讨会论文汇编 1．2．3PCR产物纯化用1．5％琼脂糖凝胶电泳观