CD69在小鼠嗜酸细胞中的表达探究.pdfVIP

本地区为亚热带沿海地区，是海鲜产地。而温暖潮湿度的气候，较适宜蟑螂和花粉的繁殖和传播。 猫毛阳性率较高考虑与宠物饲养的增加有关，而大蚂蚁的阳性率较高，本试验表明仅次于尘螨，占 24.5% ，其原因有待进一步研究。因此，哮喘患儿通过皮肤过敏原试验，寻找致敏原，避免接触和适 当进行减敏治疗，是避免和控制哮喘发作的重要措施之一。 CD69 在小鼠嗜酸细胞中的表达研究 汪慧英 沈华浩 James Lee Nancy A Lee 浙江大学医学院附属二院呼吸内科 浙江大学呼吸病研究所 哮喘的基本病理生理特征是以嗜酸细胞（Eosinophils ，Eos ）浸润为主的气道慢性炎症和气道 高反应性（AHR ）。Eos 在气道的激活是哮喘发病机制的关键，其中Th1、Th2 细胞对Eos 起着不同 的作用。CD69 是一种细胞表面分子，在细胞激活后极早期即有表达，是细胞表面活化标记分子。本 文通过细胞刺激因子刺激小鼠Eos 观察在不同时刻CD69 表达的动力学变化，并以不同的Th1、Th2 细胞因子直接培养小鼠Eos ，观察CD69 的表达以阐明不同的细胞因子对Eos 的直接作用。 材料与方法 一、材料 1．实验动物 IL-5 转基因小鼠，这种IL-5 转基因小鼠来自MAYO CLINIC LEE 实验室中转基 因株NJ.1638 ，是在C57BL/6J 的基因背景上与从JACKSON 实验室买来的小鼠连续杂交 12 代以上 而得，该小鼠外周血中成熟得T 细胞持续分泌IL-5 ，使得外周血中得得Eos 远远高于普通小鼠，可 大于100，000 个/mm3 ，占外周血细胞总数的50% 。 2 ．实验仪器 磁性细胞分离系统（MACS ，Miltenyi Biotec 公司，美国），低温梯度离心机 （BeckmanJ2-21 ，Beckman 公司，美国），流式细胞仪（FACScan ，Bluelion Biotech 公司，美国）， CO2 培养箱（2306TC ，SHELLAB 公司，美国）。 3 ．实验试剂 CD45-R （B220 ）和CD90 （Thy 1.2 ）磁珠抗体（Miltenyi Biotec 公司，美国）， 佛波醇脂（PMA ，Phorbol 12-myristate 13-acetate ，Sigma 公司，美国）和离子酶素（MA ，ionomycin ， Sigma 公司，美国），PI ，FITC-抗CD69 抗体（BD Biosciences 公司，美国），IL-4 ，IL-5 ，IL-12 ，IL-13 ， GM-CSF ，IFN-γ （RD Systems 公司，美国）。DEME 培养液（Gibco 公司，美国） 二、方法 1．Eos 的提纯 提纯IL-5 转基因小鼠外周血中的Eos 。从小鼠的尾静脉采血，收集至含20U/ml 肝素的PBS 中，然后置于Percoll 梯度离心液上，4°C 下2000 转/分离心45 分钟，取上层细胞成分 以蒸馏水溶血冲洗，所剩余的细胞含T 细胞、B 细胞和Eos ，再通过MACs 系统，进行阴性选择除 去与抗体磁珠结合的T 细胞、B 细胞。所得细胞以.RPMI 1640 冲洗2 次后重新溶于PBS 中，4°C 保 ·83 · 存。使用之前先以 DiffQuick 染色涂片确认细胞的纯度98% ，以trypan 蓝染色确认存活率99% 。 然后以流式细胞仪测定细胞表面CD69 的表达。 6 个/ml 浓度悬浮于DEME 培养液中，以24 孔平板 2 ．PMA+MA 激活作用 提纯的Eos 以1×10 -7 培养，37°C ，5%CO2 以10 M 的PMA 和 MA 刺激Eos ，并在1h、12h、18h、24h 测定细胞表面CD69 的表达及细胞存活率，以单纯DMEM 培养细胞为对照组。