可转化人工染色体(TAC)克隆载体与其在果树基因工程研究中的应用前景.pdfVIP

园艺学进展 (第五辑) 可转化人工染色体 T《AC)克隆载体及其在果树基因 工程研究中的应用前景 胡桂兵’,2 张上隆2徐昌杰2 (’华南农业大学园艺学院，广东广州510642; z浙江大学园艺系，浙江杭州310029) 摘 要 简要介绍了几种主要克隆载体的种类、特点，并对新型克隆载体一可转化人工染色 体克隆载体的优点及其在果树基因工程上的应用前景作较为详细的阐述。 关键词克隆载体，可转化人工染色体果‘树，应用前Y 在基因工程研究中，克隆载体是克隆DNA片段必不可少的元件之一。克隆载体一方面 可以作为运载工具，将目的基因转到宿主细胞中去;另一方面还可以在细菌内对目的基因进 行大量的复制和增殖。作为基因工程载体又必须具备以下特征:①在宿主细胞中能够保存并 能大量复制;②有多个单一的限制性酶切位点，便于基因与载体的重组;③有一定的标记 基因，便于重组子的筛选。天然载体往往不能满足上述要求，故需对载体进行人工改建。自 Cohen等[91第一次引入质粒pKIO1作为基因组文库克隆载体以来，克隆载体已成为分子生物 学领域内一个备受关注和进展非常迅速的研究方向。本文拟简要介绍各种主要克隆载体的种 类、特点，并对新型克隆载体一可转化人工染色体 (Transformation一competentArtificialChro- mosome,TAC)克隆载体的优点及其在果树基因工程上的应用前景作较为详细的阐述。 1克隆载体的主要种类及特点 1.1质粒 (Plasmid) 质粒载体为环状质粒，以大肠杆菌为宿主细胞，质粒的大小从1一200k6以上不等，插人 的DNA片段只有7一lOkb。代表性的质粒载体有:pSC101,pBB322及其衍生质粒、PUC等。 1.2哇菌体 B《acteriophage) Mury等[421改造野生型噬菌体，构建了一种以大肠杆菌为宿主的线型载体DNA分子，它 的插人容量提高到17一20k6，通过两次包装后具有高效转导能力，因而被广泛应用，尤其适 合材料来源有限的。DNA文库的构建。但用噬菌体作载体构建真核生物基因组文库时，其容 量却受到限制，最大片段不超过23k6. 1.3 拈粒 (Cosmid) 粘粒载体由质粒的复制起始点、1个或多个限制性内切酶识别位点、抗药性标记和噬菌 体Cos粘性末端构建[’。〕。粘粒载体的大小只有4一6个kb，而容量可达29一45k6，并且进一 步改造的具有Cos位点的粘性载体可定向克隆基因，带有真核生物DNA片段的穿梭粘粒能通 过转染进人真核生物细胞并进行转录表达，通过蛋白质功能来分析克隆基因[18,291，因此粘 粒文库一般是为克隆目的基因而构建的。 1.4 醉母人工染色体 Y《eastArtificialChromosome,YAC) 要使人工构建的染色体在细胞中能自主复制，分离到子细胞中去，具有一定的遗传稳定 26 胡桂兵等:可转化人工染色体 (TAC)克隆载体及其在果树基因工程研究中的应用前景 性.该染色体至少应具备复制原点 (OriginofReplication),着丝点 (Centromere)和端粒 (Telonmere)。随着来自酵母菌染色体着丝点，具复制原点功能的自主复制序列 (Autonomous ReplicatingSequences)分离成功，构建人工染色体的愿望逐渐变为现实。Murry等1251将这3组 元件连接在一个载体上，构建了世界上第一个人工染色体。进一步研究还发现:人工染色体 的长度是影响复制和分离的重要因素。Burke等181构建了能克隆大片段的YAC载体，并证明 YAC插人的DNA片段至少是噬菌体、枯粒等插人片段的10倍以上，可用于构建高等动物和 人的完整基因组文库。使用YAC作为基因组文库构建中的克隆载体，由于其插人片段大，克 隆的外源片段可达100一2000kb,所以只需较少的克隆数便可筱盖整个基因组，使得构建高 等生物基因组的物理图谱和遗传图谱成为可能。另外，由于YAC的插人片段长.能获得完整 的大而复杂的基因，包括远处的调控序列，所以YAC已成为基因工程的主要载体和基因组分 析的有力工具。现已成功构建了牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物和人以及拟南芥、玉米、 番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等植物的YAC文库侧。 虽然YAC能插人较大的片段，但操作中发现:YAC稳定性不好，操作也不方便，具有 自身难以克服的一些缺点。主要表现在:①存在嵌合现象。共连接、单一YAC在酵母细菌细 胞中的缺失、重排及两个或两个以上完整或不完整的YAC进人酵母后发生同源重组，都可以