壳聚糖体外抗幽门螺杆菌机理地研究.pdfVIP

壳聚糖体外抗幽门螺杆菌机理的研究 谢勇 谢正兴周南进龚燕锋周小江陈江吕农华 摘要：目的探讨壳聚糖抗HP的作用机理。方法将Hp与壳聚糖溶液作用48和24小时 后，取上清测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和葡萄糖含量，并在透射和扫描电镜下观察HP 的细菌形态和超微结构变化。结果①HP菌与壳聚糖溶液作用后上清液中渗漏的AST活性和葡萄 糖含量显著高于对照组(P0．01或P0．05)；②透射电镜结果：HP形态多样，以球形体为主，并 可见v形、u形和不规则形；HP茵胞壁变薄不完整，有的茵体细胞壁部分或全部脱落消失，细 菌轮廓模糊，结构不清，且发生不同程度的凹陷变形，甚至穿孔和破碎；胞浆内容物稀疏，空隙 明显扩大；细菌内部结构消失或分布异常，胞质不均匀或密度下降，出现高电子密度颗粒。③扫 描电镜结果：HP形态多样，以球形体为主，并可见u形和不规则形；细菌表面广泛改变，黏附 有可折射物质，外观呈毛刺状。结论壳聚糖可能通过破坏HP外膜的结构、功能和通透性，使细 茵内容物渗出，细菌破裂；和从破损的细胞外膜进入HP茵内，与胞质作用，扰乱其代谢这二方 面机制发挥抗HP作用。 关键词：幽门螺杆菌、壳聚糖、渗漏、超微结构 幽门螺杆菌(HelicobacterPylori，HP)已被公认为慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致 病因子，有效根除HP对于预防HP相关性疾病的发生具有十分重要的意义。目前根除HP虽有多种 药物联合疗法，但仍存在许多问题，如HP耐药菌株的产生，药物价格昂贵，副作用大以及病人依 从性差等，人们一直试图寻找更为理想的抗HP新药。壳聚糖是甲壳质脱乙酰衍生物，是一个来源 丰富、无毒、可吸收降解的天然氨基葡聚糖。大量的研究证实壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌 性能，它可抑制多种细菌和真菌等的生长u。4-。我们以前的研究证实壳聚糖在体外具有抗HP作用悔1。 然而壳聚糖抗HP的作用机制目前尚不清楚，为此本文研究了壳聚糖作用后HP外膜屏障功能和和 超微结构的改变，以探讨壳聚糖抗HP的作用机制，为壳聚糖的临床应用提供实验依据。 材料和方法 1．材料 Strain 1．1茵株与试剂。HP国际标准菌株Sydney 生物制品有限公司；空肠弯曲菌琼脂基础和布氏肉汤培养基础购自中国腹泻病控制上海试剂供应 中心：葡萄糖检测试剂购自四川省迈克科技有限责任公司；天门冬氨酸氨基转移酶试剂购自上海 华科一东菱诊断用晶有限公司。 公司)；HITACHl7150全自动生化分析仪(日本日立公司)；HITACHIS-570扫描电镜(日本日立公 司)；HITACHIH一600透射电镜(日本日立公司)。 2．方法 2．1壳聚糖及其衍生物诱发HP菌内容物渗漏试验 ．217． 2．1．1不同壳聚糖溶液的配制：经多次抑菌试验，选择了6种抑菌作用较好的壳聚糖溶液， 做细菌内容物渗漏试验。这6种壳聚糖溶液见表l 表1渗漏实验中种壳聚糖溶液的配制 以5mmol／L磷酸缓冲液(pH6．0)配制上述溶液。以5mmol／L磷酸缓冲液为对照组。 2．1．2 HP培养及与壳聚糖溶液作用：将HP标准菌株接种在含7．5％无菌羊血的空肠弯曲菌 酸缓冲液(PH6．0)洗脱细菌，洗涤3次后，加入上述壳聚糖溶液中，细菌浓度为108CFu／ml，将每 种壳聚糖一HP混台液加入24孔加样板中，每孔2ml，每种溶液做5孔，在37‘C和微需氧条件下， 冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。 2．1．3上清液中葡萄糖含量的测定：采用GOD-POD法检测上述上清液中葡萄糖含量，按试 避免壳聚糖中的糖干扰测试结果，每一测定管的A值，均减去其相应的壳聚糖管的A值作为其实 际吸光度。根据以下公式计算葡萄糖含量(mg／L)：Au／As×Cs×180／50 All·为测定管吸光度；As：标准管吸光度：Cs=5．55；180为葡萄糖分子量 活性。 2．2壳聚糖及其衍生物对HP菌形态及超微结构影响试验 与渗漏实验相似，取pH为6．0，浓度为1％的DD，o壳聚糖和DD刚壳聚糖溶液与HP菌作用24 小时后，离心取细菌沉渣，按以下方法制成电镜片：①透射电镜：取上述经壳聚糖作用的HP菌，