环介导等温扩增技术对牛奶中沙门氏菌快速检测地研究.pdfVIP

环介导等温扩增技术对牛奶中 沙门氏菌快速检测的研究 万 进 张 璐 曹兴元 中国农业大学动物医学院，北京 100193 摘要：环介导等温扩增技术 （LAMP）是一种新型的基因扩增方法，它具有高特异性、高灵敏度、便捷、成本低等特 点,因而广泛应用于临床检测。本实验以沙门氏菌高度保守基因fimY基因为靶基因设计两对引物 （F3B3、FIPBIP），建立 LAMP反应体系。经试验分析对体系特异性、Mg2+浓度、反应时间、反应温度进行了优化和摸索，对35株临床菌株均检出达 100％,其他阴性菌株基因组均无检出，在人工添加样品检测得其在牛奶中灵敏度为33CFU/管。实验结果表明，该方法耗时 少、具有高特异性，适合牛奶中沙门氏菌污染的快速检测。 关键词：环介导等温扩增；沙门氏菌；实时荧光定量PCR；快速检测；牛奶 ATCC一49399、粪肠球菌ATCC一35667、志贺氏菌 ATCC一25931、结肠弯曲菌及其临床分离株，均为 本实验室保存；pUCl8质粒购自Invi仃ogen；Premix EX Premix Ex Mix购自TAKARA．SYBR Taq Real time)购自TAKARA，Bst Taq(Perfect DNA Biolabs公司： polymerase购自NewEngland betaine购自Sigma公司：dNTPs购自TAKARA；细 菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限 公司：细菌增菌培养基购自北京陆桥技术有限责任 公司：Chrom04实时定量PCR仪购自Bio—rad； LAMP实时浊度仪购自北京蓝谱公司。 (二)引物的设计根据GenBank上沙门氏菌 fimY基因(登录号：7553052)序列设计两对引 物：2条外引物F3和B3，2条内引物FP和BIP，FP 由Flc+F2组成．BIP由B1c+B3组成，扩增目的序列 大小为172bp。引物由北京博迈德科技发展有限公 司合成．序列如表l所示。 表1 LAMP引物序列裹 引物名称 核酸序列(5’一3’) F3 CAAAATCTGGCCTCTGTAC B3 CCTGTGGGGAAGGTTAAG FIP CGGCTAAAGCTTTCCGATGCCTTGTTATCA GCCGCCG Bm AGCACGTCAGCAAAGCGTACCATAAGTTG TTAAGCC 二、实验步骤与方法 (一)细菌基因组提取本实验分别采用了两 种细菌基因组提取方法：(1)使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取．方法详见天根细菌基因组DNA 提取试剂盒使用说明书：(2)水煮法提取，方法如 000 下．取lmL摇菌过夜的菌液，以12rpm／min离 心l TE min。然后弃掉上层液体，加人300斗L的lx mMTris-HCl1 mMEDTA 缓冲液(10 pH=8．0) 000 重悬．然后以12 min，弃掉上层 rpm／min离心1 液体．加入100 lxLl×TE缓冲液100℃水浴下作用 15min之后．12000 min吸取上清液 rpm／min离心3 即为水煮法粗提的沙门氏菌基因组。 (二)建立LAMP反应体系根据LAMP反应原 理以及注意事项．配制LAMP反应体系，反应体系 mmol／L