鸭疫里默氏杆菌、鸭源致病性大肠杆菌与鸭沙门氏菌的RAPD研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集(2004年) 鸭疫里默氏杆菌、鸭源致病性大肠杆菌和鸭沙门氏菌的RAPD研究‘ 汪铭书，程安春t李淑梅“2陈孝跃1 f1．四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，动物疫病和食品安全评价四川省重点 2．河南职业技术师范学院，新乡，453003) 实验室．四川雅安，625014： 本文以4株不同血清型的鸭疫里默氏杆菌(RA)、5株不同血清型的鸭源致病性大肠 杆菌(E．coli)和5株同一血清型的鸭沙门氏菌(Sal．)为研究对象，分别提取基因组DNA， 利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组进行DNA分析，从20条随机引物 中筛选出能在这三种菌中有较好多态性的8条随机引物进行分析：8个有效引物共扩增出 102个DNA片段，其中14个菌株共有的谱带仅有l条，显示多态性的片段有101个， 占99％：对RA的4个菌株扩增出的谱带数为51条，共同片段有12条，多态性片段39 条，占76．5％；对Sal．的5个菌株扩增出的条带数为46条，共同片段为13条，多态性片 段33条，占71．7％；对E．coli的5个菌株扩增出的条带数为48条，共同片段4条，多态 性片段44条，占9I．7％。进一步又在8条引物中筛选出一条引物G12，其图谱中535bp的 作为分子标记鉴别这三种菌。 关键词：鸭疫里默氏杆茵；大肠杆菌；沙门氏茵；RAPD；多态性分析；鉴别 鸭疫里默氏杆菌病、鸭大肠杆菌败血症和雏鸭沙门氏菌感染是养鸭生产中最为常见 的细菌性传染病，这三种病原在临床上常以原发或继发于其他疾病出现，有时发生两种 或三种细菌的混合感染。由于这三种病原感染雏鸭后出现的临床症状和病理变化极为相 似，鉴别诊断有一定的难度，加上这三种细菌血清型众多，依靠测它们的基因序列来发 现它们基因水平的异同进行有效鉴别是不现实的。传统的鉴别方法是采用细菌培养和生 化鉴定，但工作量大、时间长。随着现代分子生物学技术的发展，出现了许多新型的鉴 琐，花费时间长，杂交还要求有探针。随机扩增多态性DNA技术(RAPD)是九十年代 初在PCR技术基础上发展起来的--i]新技术．即利用一系列不同的随机排列碱基序列的 寡核苷酸单链(一般为10碱基聚合体)为引物，利用多聚酶链式反应对DNA进行扩增． 已成为遗传图谱构建、基因定位、品种鉴定、分类研究及遗传变异检测等的一种强有力 的工具。本文采用RAPD技术对4株不同血清型的鸭疫里默氏杆菌(RA)、5株不同血清 型的鸭源致病性大肠杆菌(E．coil)和5株同～血清型的鸭沙门氏菌(Sal．)进行多态性 分析和分类鉴定。 ’本项目获四川省应用基础研究项目(编号03JY029．035．1)资助 作者简介：汪铭书(1964年一)．女，博士，教授．主要从事微生物和分子生物学的教学和研究工作 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集(2004年) 1材料与方法 1．1材料 椿、s4株和s5株，血清型均为3，10：e，h1，6)和鸭大肠杆菌(Escherichiacoil．E1株为o．血 清犁，E2株为02血清型，E3株为0s血清到，E4株为om血清型，E5株为0，。血清型)均由 四川农业大学禽病中心分离、鉴定和保存。 DNAladder marker为宝大连生物工程有 raq酶、dNTPs为上海生物工程公司产品；100bp 限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。 1．1_3随机引物购自北京赛百盛公司，其编号和序列见表1。 表l 随机引物编号及其序列 Tablel Codeand ofrandomusedin Sequence primersstudy 引物编号碱基序列(5、_3’)引物编号碱基序列(5’．3’)引物编号碱基序列(5’．3、)引物编号碱基序列(5、一3、) 一!!韭 !!业塑堡 !塑! !!g!!!堡 !!韭 !19111堡 塑塑 !!g!!!堡 G01 CTACGGAGGAG06 GTGCCTAACCG】l TGCCCGTCGTG16 AGCGTCCTCC G02