一株产细胞毒活性物质放线菌地研究初报.pdfVIP

一株产细胞毒活性物质放线茵的研究初报 胡申才1一，闫莉萍1一，郭鹏2，洪葵1。 (1．华南热带农业大学，中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，海南海t：／571107； 2．武汉大学药学院，湖北武汉430072；3．华中农业大学农业微生物重点实验室，湖北武汉430070； 4。华南热带农业大学工学院，海南海口 571107) 摘要 从海口红树林土壤分离的放线茵060524菌株显示了较强的细胞毒活性。对该菌株的形态 特征等生物学性状，及其产生的细胞毒活性物质的理化性质和生物学性质进行了研究，并且对其产物进行 了初步纯化。结果表明：060524菌具有良好的遗传稳定性，在黄豆粉培养基上产活率高，产生的细胞毒活 性物质是分泌于胞外的。产生的活性物质极性较弱，其具有较好的酸碱稳定性和耐pH值稳定性。该菌 具有一定的开发价值。 关键词海洋微生物；链霉菌；生物活性物质；细胞毒 海洋微生物因长期生活于高盐、高压、低温、寡营养及无光照的环境中，有着不同予陆地微生物的代谢途径，能产生一些 结构新颖、作用独特的代谢产物，因此海洋微生物是产生新的生物活性物质的极为重要的来源之一【1一．J。在我们开展的从海 洋微生物中寻找细胞毒生物活性物质的研究中，在海南岛浅海区分离到多株具细胞毒活性的海洋微生物。其中一株分离自 海藻的链霉菌属060524菌株显示了较强的细胞毒活性。本文将对该菌株的生物学特征及其产生的细胞毒活性物质理化性 质等方面的初步研究结果做一报道。 1材料与方法 1．1茵株 060524菌株系从海南岛浅海区分离自海藻的一株链霉菌。 1．2细胞系 小鼠黑色素瘤B16一fD细胞系，购自武汉大学典型培养物保藏中心。 1．3培养基 基：以高氏培养基为基础，改变氮源为蛋白质。 玉米培养基[6】：玉米粉2％黄豆粉2％磷酸氢二钾O，1％碳酸钙0．6％pH值7．2。 黄豆粉培养基l【7]：可溶性淀粉2％黄豆粉1．5％酵母粉0．5％蛋白胨O．2％cac030．4％pH值7．2。 黄豆粉培养基2【7】：可溶性淀粉O．5％黄豆粉2％酵母粉O．2％蛋白胨0．2％葡萄糖2％碳酸钙0．2％磷酸氢二钾 0．05％硫酸镁0．05％pH值7．2。 黄豆粉培养基3…：可溶性淀粉2％黄豆粉1．5％酵母粉0．5％蛋白胨0．2％葡萄糖O．5％碳酸钙0．4％磷酸氢二钾 0．05％pa值7．2。 基金项目：国家该技术研究发展计划(863tt兜J)海洋生物技术青年基金(21)02AA62．8140) ．It k1022@163．net 通讯作者：F21强nl ·537· 第一届海洋生物高技术论坛论文集 1．4茵丝形态观察 用无菌镊子取无菌盖玻片，在已划线平板上以妒一450的角度斜插入琼脂培养基内(插入深度约占盖玻片1／2长度)。将 插片平板倒置于28℃温箱中培养7d。用镊子小心取出盖玻片，并将其背面附着的菌丝体擦净。然后将盖玻片有菌的一面向 下放在洁净的载玻片上，在光学显微镜下进行观察[9J。 1．5 16SrDNA全序列分析 3’)扩增16sRNA基因，将16SrDNA克隆到PM∞一T载体，转化DHSa，送到上海生工进行测序。将所测的16SrDNA序列与 C,eneBank数据库中已有序列比较，并从数据库获得相关种和相关属的16SrDNA序列，用ClustalX(Veision1．8)软件进行多序列 比对以及系统发育树的构建，系统发育树的构建采用Neighbor—Join法。 1．6细胞毒活性检测[12] X 胞，用血球计数板计数，调整细胞浓度为7．5 nm 培养24h，加入待测样品，继续培养3d后加入5mg／mL的MTF溶液12皿，再培养4h，加入DMSO100t．tL充分振荡，测定570 处的吸光值，同时测定参考波长490hm处的吸光值。 1．7遗传稳定性实验 将060324菌株连续传代五次，而后用黄豆粉培养基发酵，取发酵上清液，用h盯r法测其对B16的ID50